镉暴露对斑马鱼早期胚胎发育和关键生殖调控基因表达的影响

发布时间：2020-08-28 03:19

【摘要】：为研究镉(cadmium,Cd)暴露对斑马鱼(Danio rerio)早期胚胎发育和生殖细胞的毒性效应,本论文设置了6个镉浓度组(0.00μmol/L、4.44μmol/L、8.90μmol/L、17.80μmol/L、26.70μmol/L、35.60μmol/L)对受精卵进行暴露。首先,分析了分裂期(2 hour post-fertilization(hpf))、原肠期(6 hpf)、体节期(10 hpf)和咽囊期(24hpf)胚胎畸形率和死亡率,证实了镉对斑马鱼早期胚胎发育造成了严重的毒性作用。在此基础上,通过检测单独镉处理和镉与N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)共同处理后胚胎活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化,明确了镉暴露对斑马鱼早期胚胎的氧化损伤效应及NAC对镉致斑马鱼胚胎氧化损伤的保护作用。进一步,通过实时荧光定量PCR检测了镉暴露后2 hpf、6 hpf、10 hpf和24 hpf胚胎的生殖调控基因vasa、nanos1、piwi、dazl表达量的变化,揭示了镉暴露对斑马鱼早期胚胎生殖调控基因表达的影响。本研究为探讨镉暴露对早期胚胎生殖发育毒性的效应机制提供了理论依据。实验结果如下:1.镉暴露对斑马鱼早期胚胎发育的毒性效应不同浓度镉暴露造成早期胚胎畸形发育,导致胚胎死亡。镉浓度高于8.90μmol/L时,2 hpf、6 hpf、10 hpf和24 hpf胚胎的畸形率均极显著性升高(P0.01)。胚胎表现为包状突起、分裂异常、外包延迟、卵黄囊水肿、尾部弯曲等畸形表型。死亡率分析显示,2 hpf胚胎的死亡率无显著性变化(P0.05),而6 hpf、10 hpf和24 hpf胚胎在镉浓度高于8.90μmol/L时其死亡率均极显著增加(P0.01)。2.镉暴露对斑马鱼早期胚胎的氧化损伤效应DCFH-DA荧光探针标记检测ROS结果显示,镉暴露后斑马鱼早期胚胎ROS含量逐渐增强,呈现浓度效应关系。尤其镉浓度高于8.90μmol/L时ROS含量显著升高(P0.05)。与单独镉处理组相比,镉和抗氧化剂NAC共同处理胚胎后,ROS含量降低,恢复至正常水平。结果表明,镉诱导早期胚胎中ROS的大量产生。MDA含量和SOD活性检测结果显示,镉暴露后早期胚胎MDA含量均随镉浓度升高逐渐增加,17.80μmol/L和35.60μmol/L镉浓度组MDA含量显著高于对照组。SOD活性在低浓度镉暴露后活性升高,在高浓度镉暴露后活性被抑制。17.80μmol/L和35.60μmol/L镉浓度暴露下,胚胎SOD活性均被显著抑制(P0.05)。而与单独镉处理组相比,镉和NAC共同处理胚胎后,MDA含量下降,SOD活性升高,均趋于正常水平。研究证实镉暴露对斑马鱼早期胚胎造成了严重的氧化损伤。3.镉暴露对斑马鱼早期胚胎生殖调控基因表达的影响通过实时荧光定量PCR检测了镉暴露后斑马鱼胚胎中生殖调控基因表达量的变化。结果显示,与对照组相比,镉暴露后胚胎发育至2 hpf时,vasa、nanos1、piwi、dazl的表达量均未见显著变化;镉暴露胚胎发育至6 hpf时,nanos1在17.80μmol/L和35.60μmol/L镉浓度下表达量显著降低;镉暴露胚胎发育至10 hpf,vasa表达量在镉浓度高于8.90μmol/L时显著下降,nanos1表达量在镉浓度高于17.80μmol/L时显著下降;镉暴露胚胎发育至24 hpf时,vasa、nanos1、piwi、dazl在镉浓度为17.80μmol/L、35.60μmol/L时表达量均显著性降低(P0.05)。镉和NAC共同处理组与单独镉处理组相比,基因表达量升高,基本恢复正常水平。综合以上研究结果,得出以下结论:(1)镉暴露导致斑马鱼早期胚胎畸形率、死亡率显著性增高。发育至不同时期的胚胎均表现出多种畸形表型,甚至可导致胚胎死亡。特别地,发育至原肠期和体节期的胚胎死亡数显著增加。(2)镉暴露导致早期胚胎中ROS的大量产生,使得MDA含量的增加,SOD活性下降,对胚胎造成了严重的氧化损伤。(3)镉暴露对生殖调控基因的表达有不同程度的影响。镉暴露斑马鱼早期胚胎后,导致生殖调控基因vasa、nanos1、piwi、dazl的表达量均显著性降低,尤其对vasa、nanos1的表达量影响更为显著。研究证明镉暴露抑制了斑马鱼早期胚胎生殖相关基因的表达。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X503.225;S917.4
【图文】：

PGCs发生与迁移[62]

物级均匀快速分裂，而镉浓度组胚胎出现包状突起、未分裂、分裂异常、分裂延迟、甚至分裂停止等畸形表型（图 2.1 B-F）。图2.1 镉暴露后2 hpf胚胎的畸形率分析（n=10）Ⅰ：镉暴露后2 hpf胚胎的畸形率；Ⅱ：镉暴露后2 hpf胚胎的畸形表型图 A，正常发育胚胎（64-细胞）； B-F，畸形发育胚胎Fig. 2.1Analysis of deformity rate of 2 hpf embryos after cadmium exposureI: Deformity rate of 2 hpf embryos after cadmium exposure (n=10); II:Analysis of abnormal phenotypeof 2 hpf embryos after cadmium exposure.A, normal embryos (64-cell); B-F, malformed embryos

I: Deformity rate of 6 hpf embryos after cadmium exposure; II:Analysis of abnormal phenotype of 6hpf embryos after cadmium exposure.A, normal embryos (50%-epiboly); B-F, malformed embryos图2.3 镉暴露后10 hpf胚胎的畸形率分析（n=10）Ⅰ：镉暴露后10 hpf胚胎的畸形率；Ⅱ：镉暴露后10 hpf胚胎的畸形表型图。A，正常发育胚胎（3-体节）；B-D，畸形发育胚胎Fig. 2.3Analysis of deformity rate of 10 hpf embryos after cadmium exposure (n=10)I: Deformity rate of 10 hpf embryos after cadmium exposure; II:Analysis of abnormal phenotype of 10hpf embryos after cadmium exposure.A, normal embryos (3-somite); B-D, malformed embryos

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本文编号：2807019