基于上转换荧光生物传感技术快速检测双酚A和雌二醇

发布时间：2020-08-31 18:09

　　水是生命之源,水质安全尤为重要,而环境雌激素逐渐成为引发水源化学性污染的重要原因。双酚A(bisphenol A,BPA)和雌二醇(estradiol,E2)作为典型的环境雌激素,因其危害范围广、影响时间长而被广泛关注,故亟待建立快速、简便、高效检测这两种物质的方法。目的本研究以BPA和E2两种典型环境雌激素为研究对象,基于上转换发光技术、生物传感技术和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)构建两种高效检测BPA和E2的传感技术体系。方法1.基于上转换荧光探针和FRET检测水中BPA。利用改进的溶剂热法合成上转换纳米颗粒(upconversion nanoparticles,UCNPs:NaYF_4:Yb~(3+),Er~(3+)),用透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)和傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)等方法表征颗粒。对UCNPs表面修饰制备荧光探针,其可与标记荧光基团的适配体实现FRET,随着体系中BPA浓度的升高,荧光强度值的变化与之呈现相应的线性关系。2.基于AuNP-AuNP-UCNP三联体结构的传感体系高效检测BPA和E2。以纳米金(gold nanoparticles,AuNPs)和上转换颗粒(NaYF_4:Yb,Er,Gd UCNPs)为光学探针,二者分别连接BPA和E2的适配体,经总互补序列连接形成AuNP-AuNP-UCNP三联体结构,当加入BPA或E2时,由于适配体和小分子之间的特异性结合,连接有适配体的AuNPs或UCNPs从三联体结构脱落,经过离心测上清液中UCNPs荧光强度和沉淀中金纳米可见吸收强度的变化同时检测BPA和E2。结果1.基于上转换荧光探针和FRET检测水中痕量BPA的实验结果:实验用NaYF_4:Yb~(3+),Er~(3+)UCNPs为六方相且分散均匀,其平均直径约为73 nm,表面包覆6 nm的硅层。在优化的反应条件下,BPA浓度在0.1 ng/mL~25 ng/mL与荧光强度呈现良好的线性关系(R~2=0.9938),检出限达到0.05 ng/mL。天津海河水的加标回收率在91.00%~108.60%之间,相对标准偏差4.5%。2.基于AuNP-AuNP-UCNP三联体结构的传感体系高效检测BPA和E2的结果:在反应温度为30℃,pH 7.8时,本方法检测BPA和E2的线性范围分别为2 ng/mL~200 ng/mL和10 ng/mL~150 ng/mL,检出限分别为0.2 ng/mL和0.5ng/mL。本方法用于实际水样中的加标回收率均在86.07%~107.35%之间,相对标准偏差6.8%,三联体结构可在4℃保存9天,检测方法稳定可靠。结论本文成功构建了两种生物传感技术体系用于BPA和E2的检测,检测方法灵敏度高、准确高效、简单实用。本研究在一定程度上为EEs的快速检测提供了技术支持,具有较好的理论价值和应用前景。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R123.1;TP212
【部分图文】：

原理图,上转换荧光,原理图,包硅

实验原理如图2.1 所示：首先合成裸的 UCNPs，再对其表面进行包硅壳和氨基修饰，之后在其表面修饰 SA，通过生物素-链霉亲和素放大系统连接 BPA 适配体，然后在体系加入 TAMRA 修饰的互补链，此时由于碱基互补配对使 UCNPs 和 TAMRA 距离拉近，而 UCNPs 的荧光光谱和 TAMRA 的吸收光谱有一定的重叠（见图 2.2），符合发生 FRET 现象的条件，致使 UCNPs 荧光猝灭

效果图,光谱重叠,效果图

上转换纳米颗粒的合成根据传统溶剂热法，经过改变实验条件制备了四组 UCNPs，并根据其后的荧光强度变化，选择荧光发光效率最强的一组进行后续实验，具件见表 2.4。表 2. 4 UCNPs 合成的实验条件组别摩尔比(Y: Yb: Er)反应温度（℃）反应时间（min）包硅时间（h）A 80:18:2 250 60 6B 80:18:2 250 90 6图 2. 2 UCNPs 和 TAMRA 的光谱重叠效果图注：a) UCNPs 的荧光光谱； b) TAMRA 的吸收光谱

三联体,检测原理,体系,适配体

.3.2 纳米探针的制备为了验证本实验所用适配体与小分子的特异性结合效果，用圆二色Circular Dichroism，CD）考察适配体结合目标物前后的构型变化，间接证者的有效结合。使用前将生工合成的两种适配体用 PBS 稀释到 10 μmol/L，℃下加热 5 min，后在冰水浴中冷却备用。参照文献[59]中的方法合成胶体金，4℃避光条件下保存备用。将胶体金分巯基修饰的 E2 适配体和巯基修饰的总互补链 cDNA 以摩尔比 1:100 混合， 50 mmol/L 的 NaCl，将体系置于恒温振荡培养箱 25℃下孵育 12 h。反应结 13000 r/min 离心 15 min，清洗，将所得沉淀重悬在 1×TBE 缓冲液中，即可 cDNA 和 E2 适配体修饰的金纳米探针，4℃避光保存备用。参照文献[60]中的方法合成上转换纳米颗粒。为使颗粒连接上适配体，先图 2. 3 三联体结构传感体系检测原理图

【参考文献】