羟基多溴联苯醚（OH-PBDEs）小鼠肝脏体外代谢及对雌激素代谢影响研究
发布时间：2020-09-07 21:29
羟基多溴联苯醚(OH-PBDEs)作为一种可由母体多溴联苯醚(PBDEs)代谢而来的产物,因其分子结构和甲状腺激素(T4)相似,能够与甲状腺激素转移蛋白(TTR)结合,进而显著影响体内的甲状腺激素水平,具有更高的内分泌干扰效应,引起了国内外学者的重点关注。目前OH-PBDEs已在环境介质、生物体甚至人体中均有检出。有研究表明OH-PBDEs可以在生物体内通过生物酶催化氧化进一步形成一相代谢产物。其代谢速率受溴原子数量及羟基、溴原子和醚键三者之间的位置等因素影响。因此有必要探索OH-PBDEs在生物组织中的代谢机理,及对生物体内雌激素代谢的影响,为更全面的评价OH-PBDEs在生物体的代谢行为和毒性效应提供理论基础。本论文以5’-OH-BDE-99、6’-OH-BDE-99、6-OH-BDE-99和6-OH-BDE-137四种典型OH-PBDEs作为研究对象,使用小鼠肝脏作为反应基质,用体外代谢的模式,研究了4种结构相似的OH-PBDEs在小鼠肝脏中的体外代谢情况,并考察对4种雌激素(E1、E2、E3、EE2)代谢的影响。使用HPLC-MS/MS定量分析代谢产物2-OH-E2;应用化学抑制剂初步探索了小鼠肝脏微粒体中代谢4种OH-PBDEs的关键酶(CYP450酶)。主要研究结果如下:(1)4种OH-PBDEs能够在小鼠肝脏S9中发生代谢,其代谢程度为6’-OH-PBDE-996-OH-BDE-995’-OH-BDE-996-OH-BDE-137,通过结构与代谢关系分析发现,OH官能团与Br原子取代位置的不同影响了4种OH-PBDEs的代谢水平。S9体系中OH-PBDEs对雌激素的代谢影响实验表明,实验中各个浓度(1.5、3、6μM)的OH-PBDEs对E1、E2代谢率没有显著性影响;而对E3代谢具有明显的抑制现象;高浓度的OH-PBDEs对EE2代谢具有抑制现象,但是不具有显著性差异。(2)4种OH-PBDEs在小鼠肝脏微粒体中代谢表明,4种OH-PBDEs相对于母体PBDEs更容易被代谢,说明了羟基官能团的引入提高了母体PBDEs的生物利用性;在与S9中代谢相同溴原子取代位相同时,结果发现醚键与OH官能团及Br原子互为邻位时代谢率最高。通过ECOD表征实验发现,4种OH-PBDEs对微粒体ECOD活性存在不同作用。总体趋势表现为随着反应体系中OH-PBDEs浓度的增加,5'-OH-BDE-99在低浓度(1.5μM)下显著促进ECOD活性(P0.05);6'-OH-BDE-99随浓度的增加,对ECOD活性的影响不明显;6-OH-BDE-99随浓度的增加会降低ECOD活性(P0.05);6-OH-BDE-137在低浓度(1.5μM)下对ECOD活性无显著影响,但是随着浓度的增加显著促进ECOD活性(P0.05)。根据抑制剂实验结果表明CYP2C9是微粒体代谢5’-OH-BDE-99和6’-OH-BDE-99的关键酶系,而CYP1A2、CYP3A4亚型更多的参与了6-OH-BDE-99和6-OH-BDE-137的代谢,其中CYP1A2的贡献最大;CYP2D6对4种OH-PBDEs的代谢起次要作用。(3)微粒体体系中4种OH-PBDEs所设浓度(1.5、3、6μM)对4种雌激素表现出不同效应。处于邻位的6-OH-BDE-99会促进E1的代谢且随着浓度的升高而趋于平缓,但当OH与Br原子处于对位(5’-OH-BDE-99)时会抑制E1在体内的代谢。此外,6-OH-BDE-99会促进E2的代谢但达到一定浓度之后E2会随着浓度增大代谢受到抑制;OH与Br原子处于对位时对E2代谢的抑制作用较为明显,说明OH-PBDEs对生物体内E2代谢的差异可能源于OH-PBDEs对代谢体系酶活性的影响所致。4种OH-PBDEs可使E3快速代谢,但对EE2的代谢没有显著影响。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R99;X592
【部分图文】：
肠，皮肤，肺，肾，睾丸和脑。其中，肝脏是 P450 介图 1.1 可见 CYP 酶可通过其催化循环增加 ROS 并改变氧化疾病发展。大量研究表明 PBDESs 经细胞色素 P450(Cyp45OH-OBDEs。含有丰富的代谢酶如细胞色素 P450s 的初级肝 OH-PBDEs 代谢的受体。是在 C—H 键中插入氧，相当于烷烃底物的羟基化。功能完色素 P450 及其氧化还原载体(包括铁硫蛋白和黄素蛋白)组中大致存在 9 个不同步骤，顺序依次进行。首先，底物与 还原酶(POR)还原一个电子，与氧结合；其次通过 POR 进行气与 Fe 平衡，生成(RH)Fe3+(O2-)(化合物 I)，失去 H 原子后最后释放产物参与下一个代谢过程(Mak et al., 2017; Vei., 2016; Groves et al., 2005; 李建华, 2014 )。CYP450s 酶系催
图 2.1 OH-PBDEs 的结构图Fig. 2.1 Concentrations of OH-PBDEs材料与材料 基 -2,2',4,4',5- 五 溴 联 苯 醚 (5'-OH-BDE-99) 、 6’- 羟 基 -2,2',4,4',5- 五E-99)、6-羟基-2,2',3,4,4'-五溴联苯醚(6-OH-BDE-99)、6-羟基-2,2',3,4,4',BDE-137)购于百灵威科技有限公司(J&K 公司)。三(羟甲基)氨基甲烷(Tr钠盐二水合物(Na2EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、牛血清蛋白(BSA)、考马斯卤灵、试卤灵、甘氨酸、7-乙氧基香豆素、7-羟基香豆素、盐酸苯胺司)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)(Sigma Aldrich 公司)；甲醇国 Merck 公司)；氨水(色谱纯)、二甲基亚枫(DMSO，药检专用)、氯化)均购于国药集团药业股份有限公司。
图 2.3 OH-PBDEs 的回收率Fig. 2.3 Recoveries of OH-PBDEs.2 OH-PBDEs 在小鼠 S9 中的体外代谢S9 的添加量对 OH-PBDEs 代谢率的影响根据图 2.4 结果显示，当 S9 添加量在 5~50 μL 范围内，OH-PBDEs 的代谢率随着 而逐渐升高， 且各目标物的代谢率存在显著性差异(p＜0.05)，达到 50 μL 时代谢大值；而后当 S9 的添加量再次增加时，OH-PBDEs 的代谢率会逐渐降低，但不存差异(p 0.05)5’-OH-BDE-99 在 S9 的添加量分别为 5、 10、 20 μL 间代谢率不存差异(p 0.05)，达到 40 μL 和 50 μL 时代谢率显著升高，且当 S9 添加量达到 80 μ率显著降低； 6’-OH-BDE-99 在 S9 添加量分别为 50、60、80 μL 间代谢率不存在异(p 0.05)； 6-OH-BDE-99 在 S9 添加量分别为 5~50 μL 间代谢率存在显著性差.05), 达到 50 μL 后代谢率有所降低；6-OH-BDE-137 在 S9 添加量分别为 40、50、6存在显著性差异(p 0.05)，当 S9 添加量达到 80 μL 后代谢率有所降低。考虑到 S
本文编号：2813860
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R99;X592
【部分图文】：
肠，皮肤，肺，肾，睾丸和脑。其中，肝脏是 P450 介图 1.1 可见 CYP 酶可通过其催化循环增加 ROS 并改变氧化疾病发展。大量研究表明 PBDESs 经细胞色素 P450(Cyp45OH-OBDEs。含有丰富的代谢酶如细胞色素 P450s 的初级肝 OH-PBDEs 代谢的受体。是在 C—H 键中插入氧，相当于烷烃底物的羟基化。功能完色素 P450 及其氧化还原载体(包括铁硫蛋白和黄素蛋白)组中大致存在 9 个不同步骤，顺序依次进行。首先，底物与 还原酶(POR)还原一个电子，与氧结合；其次通过 POR 进行气与 Fe 平衡，生成(RH)Fe3+(O2-)(化合物 I)，失去 H 原子后最后释放产物参与下一个代谢过程(Mak et al., 2017; Vei., 2016; Groves et al., 2005; 李建华, 2014 )。CYP450s 酶系催
图 2.1 OH-PBDEs 的结构图Fig. 2.1 Concentrations of OH-PBDEs材料与材料 基 -2,2',4,4',5- 五 溴 联 苯 醚 (5'-OH-BDE-99) 、 6’- 羟 基 -2,2',4,4',5- 五E-99)、6-羟基-2,2',3,4,4'-五溴联苯醚(6-OH-BDE-99)、6-羟基-2,2',3,4,4',BDE-137)购于百灵威科技有限公司(J&K 公司)。三(羟甲基)氨基甲烷(Tr钠盐二水合物(Na2EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、牛血清蛋白(BSA)、考马斯卤灵、试卤灵、甘氨酸、7-乙氧基香豆素、7-羟基香豆素、盐酸苯胺司)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)(Sigma Aldrich 公司)；甲醇国 Merck 公司)；氨水(色谱纯)、二甲基亚枫(DMSO，药检专用)、氯化)均购于国药集团药业股份有限公司。
图 2.3 OH-PBDEs 的回收率Fig. 2.3 Recoveries of OH-PBDEs.2 OH-PBDEs 在小鼠 S9 中的体外代谢S9 的添加量对 OH-PBDEs 代谢率的影响根据图 2.4 结果显示，当 S9 添加量在 5~50 μL 范围内，OH-PBDEs 的代谢率随着 而逐渐升高， 且各目标物的代谢率存在显著性差异(p＜0.05)，达到 50 μL 时代谢大值；而后当 S9 的添加量再次增加时，OH-PBDEs 的代谢率会逐渐降低，但不存差异(p 0.05)5’-OH-BDE-99 在 S9 的添加量分别为 5、 10、 20 μL 间代谢率不存差异(p 0.05)，达到 40 μL 和 50 μL 时代谢率显著升高，且当 S9 添加量达到 80 μ率显著降低； 6’-OH-BDE-99 在 S9 添加量分别为 50、60、80 μL 间代谢率不存在异(p 0.05)； 6-OH-BDE-99 在 S9 添加量分别为 5~50 μL 间代谢率存在显著性差.05), 达到 50 μL 后代谢率有所降低；6-OH-BDE-137 在 S9 添加量分别为 40、50、6存在显著性差异(p 0.05)，当 S9 添加量达到 80 μL 后代谢率有所降低。考虑到 S
【参考文献】
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