孔雀石绿降解菌的分离鉴定、降解特性及机理研究

发布时间：2020-09-10 17:53

　　养殖水环境中孔雀石绿残留导致水产品中孔雀石绿超标问题时有发生,严重影响人体健康。利用微生物降解水环境中孔雀石绿的应用前景广阔,本文筛选并鉴定具有高效孔雀石绿降解能力的菌株,系统研究菌株的孔雀石绿降解特性,利用RNA-Seq技术筛选孔雀石绿抗性和降解相关的关键基因和代谢通路,在转录组水平上初步揭示菌株的孔雀石绿降解机理。目前,还没有成熟的方法用于解决水环境中孔雀石绿超标问题。本研究的开展不仅为微生物孔雀石绿降解基因的筛选和降解机理的研究提供重要参考,同时为孔雀石绿降解微生物和酶制剂的开发和利用奠定重要理论基础。1.采用硼氢化钾还原-高效液相色谱法检测样品中的孔雀石绿。孔雀石绿加标浓度在1mg·L~(-1)~20 mg·L~(-1)内,该方法的回收率为88.357%~94.135%,相对标准偏差为0.035%~2.599%,符合检测要求。从长期受孔雀石绿污染的养殖池塘底泥中筛选分离到2株能够高效降解孔雀石绿的菌株,分别命名为WA-1和B-20。经研究发现,在LB培养基中,菌株WA-1和B-20对20 mg·L~(-1)孔雀石绿在24 h内的降解率分别为99.8%和97.2%。经API 20E鉴定卡和VITEK 2 GN微生物鉴定系统及16S rRNA序列初步鉴定发现,菌株WA-1为克雷伯氏菌属,重新命名为Klebsiella sp.WA-1,菌株B-20为肠杆菌属,重新命名为Enterobacter sp.B-20。2.Enterobacter sp.B-20在LB培养基中对1~40 mg·L~(-1)孔雀石绿有较强的降解能力。Enterobacter sp.B-20在12 h内对1 mg·L~(-1)降解率达到92.2%,对5~40 mg·L~(-1)孔雀石绿的降解率均超过82.4%,24 h内对5~20 mg·L~(-1)孔雀石绿降解率均超过97.1%。Enterobacter sp.B-20的孔雀石绿降解率随着pH的增加而显著提高,最适降解pH为9。同时Enterobacter sp.B-20具有较强的耐盐性,在1%~4%的NaCl浓度具有稳定的孔雀石绿降解特性。Enterobacter sp.B-20在0.1~2 mmol·L~(-1) Zn~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)、Pb~(2+)和Ca~(2+)等金属离子条件下表现出较强的耐性及稳定的孔雀石绿降解能力,而且0.1~1 mmol·L~-11 Fe~(3+)、0.1~0.5 mmol·L~-11 Cu~(2+)、0.1 mmol·L~-11 Mn~(2+)、0.1~1 mmol·L~-11 Pb~(2+)均能显著提高菌株的孔雀石绿降解率。3.Klebsiella sp.WA-1能够在不需要任何无机或有机营养物质条件下发挥孔雀石绿降解作用。Klebsiella sp.WA-1对水溶液中1~40 mg·L~(-1)孔雀石绿降解能力较强,在0.5 h内对1~20 mg·L~(-1)孔雀石绿的降解率均超过94.0%,12 h内对1~40 mg·L~(-1)孔雀石绿的降解率超过94.4%。Klebsiella sp.WA-1的孔雀石绿降解率随着pH值的升高而逐渐增加,这种增加作用主要由于高pH值下孔雀石绿发生自然降解作用。Klebsiella sp.WA-1在1%~4%的NaCl浓度范围内表现出稳定的孔雀石绿降解特性,12 h内对5 mg·L~(-1)和40 mg·L~(-1)孔雀石绿的降解率均达到97.0%和94.0%以上。Klebsiella sp.WA-1的最适孔雀石绿降解温度为37℃,高温条件较低温条件更适宜于该菌发挥孔雀石降解作用。在添加0.1~1 mmol·L~(-1) Zn~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)、Pb~(2+)和Ca~(2+)等金属离子条件下Klebsiella sp.WA-1表现出较稳定的孔雀石绿降解能力。添加0.1~0.5 mmol·L~(-1) Mn~(2+)、0.1~1 mmol·L~(-1) Mg~(2+)、0.1 mmol·L~(-1) Cu~(2+)能够显著提高Klebsiella sp.WA-1的孔雀石绿降解能力。4.采用RNA-Seq技术研究菌株Enterobacter sp.B-20在不同浓度孔雀石绿作用下基因表达差异,选择FPKM值为2倍差异变化且Adjusted P-value0.05的基因作为差异表达基因进行GO富集和KEGG通路富集分析。CK组与M5组共筛选出差异表达基因115个,与CK组相比,M5组上调和下降的显著差异基因分别为80和35个。CK组与M20组共筛选出差异表达基因466个,M20组上调和下降的显著差异基因分别为229和237个。筛选出多种与孔雀石绿及其代谢产物抗性和降解相关的关键基因和代谢通路:多种运输糖类等环状化合物的ABC转运蛋白可能涉及孔雀石绿的细胞内转运;多种ABC、MFS、RND转运蛋白家族的药物外排蛋白对于Enterobacter sp.B-20的孔雀石绿及其代谢产物抗性有重要作用;多种三苯甲烷还原酶和芳香族化合物降解相关基因在孔雀石绿诱导下显著表达,表明这些基因在Enterobacter sp.B-20孔雀石绿及其代谢产物降解上发挥重要作用。
【学位单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X172
【部分图文】：

最大似然法,系统进化树,菌株,基因序列

饷蛐蛄杏?WA-1 的 16S rRNA 基因序列构建系统进化树(图2-3)。经计算，菌株 WA-1 16S rRNA 基因序列与 Klebsiella pneumoniae subsp.rhionscleromatisATCC13884 标准菌株最为相似，两者同源性为 99%，由此初步确定所分离的孔雀石绿降解菌株 WA-1 为 Klebsiella sp.。Enterobacter asburiae JCM 6051 BBED01000197Enterobacter bugandensis EB-247 HQ122932Enterobacter cancerogenus LMG 2693 Z96078Enterobacter aerogenes KCTC 2190 CP002824Enterobacter soli ATCC BAA-2102 LXES01000062Enterobacter ludwigii EN-119 JTLO01000001Enterobacter kobei DSM 13645 CP017181Enterobacter cloacae subsp. dissolvens LMG 2683 Z96079Enterobacter cloacae subsp. cloacae ATCC 13047 CP001918Enterobacter siamensis C2361 HQ888848Enterobacter sp. B-20Enterobacter muelleri JM-458 KP345900Enterobacter tabaci YIM Hb-3 KP990658Enterobacter mori LMG 25706 GL890774Enterobacter hormaechei subsp. hormaechei ATCC 49162 AFHR01000079Enterobacter hormaechei subsp. oharae DSM 16687 CP017180Enterobacter xiangfangensis 10-17 HF679035Enterobacter hormaechei subsp. steigerwaltii DSM 16691 CP017179Enterobacter massiliensis JC163 CAEO0100017136918569

曲线,孔雀石绿,降解动力学,曲线

菌体用蒸馏水洗涤 2 次，80 ℃烘至恒重后称重，计算生物分析验处理重复 3 次，实验结果均以平均值±标准偏差表示。采用 SPSS因素方差分析（One-WayANOVA），应用多重比较 Tukey 检测对各异性进行检验，不含有相同字母表示组间差异显著：生物量间差异.05；孔雀石绿降解率间差异用小写字母表示，P<0.05，“*”表示与P<0.05。结果与讨论erobacter sp.B-20 孔雀石绿降解动力学曲线bacter sp.B-20 对不同浓度孔雀石绿（5~20 mg·L-1）的降解动力学曲

孔雀石绿,初始浓度,菌株

浓度孔雀石绿条件下降解孔雀石绿的应用前景。雀石绿初始浓度对 Enterobacter sp.B-20 孔雀石绿降解的影响孔雀石绿浓度（1~40 mg·L-1）对 Enterobacter sp.B-20 的生长和孔雀石2。与正常培养组相比，孔雀石绿（5~40 mg·L-1）的添加显著抑制了菌石绿对菌株有一定毒害作用。与菌株生物量变化相似，菌株的孔雀石绿浓度的升高呈逐渐下降的趋势。孔雀石绿浓度为 1 mg·L-1时菌株的）；孔雀石绿浓度升高到 40 mg·L-1时，孔雀石绿的降解效果相对较低 82.4%。

【参考文献】