近江牡蛎Gnaq对Hsc70基因的转录调控及其对温度和污染物的响应模式

发布时间：2020-09-17 20:25

　　热休克蛋白70(Heat shock proteins 70,HSP70s)包括组成型表达的HSC70和诱导型表达的HSP70,是参与生物生命活动的重要分子。近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)是重要经济贝类,当其受到污染物等胁迫因子作用时,其体内的HSC70基因表达水平发生改变,其表达受到转录因子的正负调控,但是目前还没有关于其正调控转录因子的报道。本文以近江牡蛎(C.hongkongensis)为实验对象,采用DNA亲和纯化和蛋白质谱检测技术筛选出与ChHsc70基因启动子有关联的Gnaq蛋白。参照近江牡蛎近源物种太平洋牡蛎Gnaq的编码区序列设计引物,以近江牡蛎的cDNA为模板,扩增出近江牡蛎Gnaq基因的编码区序列。通过RACE全长扩增技术和蛋白质三维结构模拟等技术,确定了ChGnaq的cDNA全长序列和蛋白质同源三维结构,通过RNAi技术,体外过表达技术、qRT-PCR技术验证了Gnaq对ChHsc70的调控作用。具体结果为:近江牡蛎ChGnaq基因全长cDNA为1476 bp,其中,5’端非编码区长度为211 bp,3’端非编码区长度为203 bp,开放阅读框为1062 bp,编码353个氨基酸。Gnaq蛋白质包含GTPase和helical两个区域;GTPase区域,是G蛋白中最为保守的区域,主要功能是作为GTP酶,参与GTP的水解,将GTP水解成GDP,同时这个区域也包含Gnaq蛋白与Gβγ和跨膜螺旋结构受体、效应分子相互结合的位点。ChGnaq基因三维结构的N末端含有一个核定位信号序列和带正电的突出的α螺旋。N末端可以将G蛋白定位于细胞核中,同时也是蛋白质与蛋白质以及蛋白质与脂质相互结合的位点。在ChGnaq mRNA被敲低的情况下,ChHsc70的mRNA水平下降,表明ChGnaq对ChHsc70的转录表达起正调控作用;在ChGnaq蛋白过表达情况下,ChHsc70启动子下游的报告基因表达量极显著升高,这也表明ChGnaq蛋白对ChHsc70的表达起正调控作用;热激或污染物处理的近江牡蛎中ChGnaq和ChHsc70两基因表达模式相似,均为先升高,达到峰值后,再回复到正常水,但是,也存在差异,一方面,ChGnaq出现显著高表达的时间早于ChHsc70的显著高表达时间,提示ChGnaq在ChHsc70显著高表达中发挥作用。另一方面,ChGnaq对温度刺激响应的时间极短,对污染物的响应时间长,ChGnaq对污染物的响应具有偏好性,是合适的辅助污染预警分子,用ChHsc70对ChGnaq的相对表达比值能矫正温度变化对污染预警分子ChHsc70指示污染发生的干扰,比值在4以上,是温变引起,比值在3以下是污染发生。研究结果表明近江牡蛎ChGnaq对ChHsc70基因的转录起正调控作用,为完善近江牡蛎ChHsc70的表达调控机制具有重要意义。ChGnaq对污染物的响应具有偏好性,是一个合适的辅助污染预警分子,可以矫正温度变化对HSC70指示海洋环境污染状况的影响,为建立海洋环境污染预警技术奠定基础。
【学位单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X52;Q953
【部分图文】：

二级结构,受体,蛋白,磷脂酰肌醇二磷酸

图 1.1 Gnaq 二级结构的线性展示图[72]Figure 1-1 Linear representation of secondary structure of Gnaq3.2 Gnaq 蛋白质的功能G 蛋白耦联型受体的信号传递过程包括：第步受体同配体之间相互结合；第二步受体进步活化 G 蛋白；第с步 G 蛋白再进步激活或者抑制细胞中的效应分子；第四步激活的效应分子改变胞内信使的含量和它的分布；第五步胞内信使作用于细胞内相应的靶分子，进而改变细胞的代谢过程以及基因表达等重要的生理功能。胞外信号被膜受体接受后，通过 Gnaq 蛋白耦合激活磷脂酶 PLCβ，将磷脂酰肌醇二磷酸PIP2分解为肌醇с磷酸 IP3和二酰甘油 DAG，产生出两个胞内信使，

示意图,细胞质内,蛋白质,转录因子

暨南大学硕士学位论文胞的分裂[85]等生命活动。Gnaq 信号通路可以通过系列磷酸化级联反应，从而磷酸化转录因子从而调控转录过程，进而参у 系列生命活动。Gnaq 信号通路通过激活я裂原活化蛋白激酶途径激活转录因子 NF-kB[86]，以及 CREB（cAMP 反应元件结合蛋白）[87]，Egr-1[88]，AP-1[89]等。其中 CREB 是类信号转录因子，被磷酸化后，可以诱导那些含有 cAMP 响应元素（CRE）的增强子的调控结构的基因的转录[90]。CREB 被各种生理刺激激活可以在许多重要的生物过程中发挥重要的作用[91]。Gnaq 通路通过活化 RhoGTPases 进步激活转录因子 SRF(血清反应因子)及其心肌素相关的共激活因子[92; 93]。SRF 是已知的控制各种细胞功能，包括细胞生存，分化，增殖和迁移的种转录因子[94]。而 AP-1，类碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子蛋白家族，在调节细胞因子表达和炎症中起重要作用[95]。

氨基酸序列,热激处理,亲和纯化,蛋白

图 2.1 DNA-蛋白亲和纯化洗脱蛋白的 SDS-PAGE 电泳检测Figure 2.1 SDS-PAGE electrophoresis of proteins isolated by DNA affinity purification注：第泳道为 Marker，Control 为未处理对照组，Heat shock 为热激处理组，CdCl2为氯化镉处理，分子标记的大小以 kDa 表示在左侧。每组各有两个浓度：200 mM 和 1 M。目标蛋白质条带的位置用箭头表示，大小在 40 kDa。3.2 质谱检测结果如图 2.2 所示，经过质谱检测后，得知该蛋白质为 Gnaq 蛋白，该蛋白质的氨基酸序列у太平洋牡蛎 Gnaq 蛋白质的氨基酸序列相似性达到 22%，因此筛选确定本实验研究蛋白为 Gnaq 蛋白。

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