纳米材料对渗滤液微生物中抗生素抗性基因的影响及其作用机理初探

发布时间：2020-09-17 21:12

　　近年来随着抗生素的广泛使用,环境中残留的抗生素诱导出大量耐药菌(Antibiotic resistance bacterial,ARB)和抗生素抗性基因(Antibiotics resistance genes,ARGs)。抗生素抗性基因在环境中的持久性残留,并且可以通过基因水平转移(Horizontal genes transfer,HGT)的方式进行扩散和传播,对人类健康和生态环境构成潜在威胁。此外,纳米技术的快速发展使得纳米材料广泛的应用于工业和日常生活,导致越来越多的纳米材料释放到环境中。然而,目前关于纳米材料对环境污染源中抗性基因影响的研究相对较少,而且作用机制有待进一步解析。因此,本论文选取不同类型的纳米材料(纳米金属、金属氧化物和碳纳米管),以垃圾渗滤液中筛选出的可培养微生物作为研究对象,探究不同纳米材料对环境微生物中抗性基因的影响及其作用机理,为新型污染物的环境效应及抗性基因扩散控制提供理论依据。主要内容与结果如下:1.纳米材料的理化性质表征及其对微生物生长的影响(1)粒度分析结果显示纳米材料的平均水力学直径均大于100 nm,通过SEM图像发现纳米材料在反应体系中发生一定程度的团聚;利用电感耦合等离子光谱仪(ICP-OES)分析纳米材料的离子溶出特性,结果表明较高浓度的纳米材料会溶出更多的离子,但离子溶出比例随纳米材料暴露浓度的增加而下降。(2)费氏弧菌(Vibrio Fischeri)对纳米材料的急性毒性表征,发现纳米材料的毒性大小为Cu NPsZn O NPsSWNTsZn NPsCuO NPsTiO_2 NPs。进一步将渗滤液中筛选培养的微生物暴露于纳米材料中,通过测定生长曲线发现SWNTs和TiO_2 NPs能刺激微生物生长;而Cu NPs、Zn NPs、ZnO NPs和CuO NPs对微生物的生长有抑制作用,其中ZnO NPs的抑制强度最大。进而SEM图像显示纳米材料可以紧密的吸附于微生物表面,但未对微生物的表面结构造成破坏。2.不同纳米材料对渗滤液微生物中抗性基因的传播影响;(1)从微生物在纳米材料的暴露实验来看,纳米材料可降低抗性基因的丰度(相对空白组),其影响程度随着纳米材料浓度增加而增大;从材料类型来看,ZnO NPs对抗性基因的削减效果最好,SWNTs和TiO_2 NPs的削减作用最小。(2)通过对各种纳米材料的不同暴露时间和暴露浓度与目标抗性基因的丰度进行冗余(RDA)分析,结果发现目标基因丰度与暴露浓度和暴露时间均呈一定的负相关,且暴露时间对目标抗性基因sul1的丰度影响最大,而暴露浓度对目标基因intl1的丰度影响最大。3.从群落结构和细胞层面探究纳米材料影响抗性基因的作用机理。(1)采用高通量测序和q-PCR技术对混合微生物菌群结构进行分析和目标ARGs定量,发现可培养微生物主要是以芽孢杆菌属为主(~98%),体系中的抗性基因主要是sul1、aadA1和intl1,且基因占比不随纳米材料的种类发生变化。(2)将微生物暴露于溶出离子中,结果表明含锌和铜的金属纳米材料可降低微生物抗性基因丰度,其中Zn~(2+)和Cu~(2+)的离子溶出效应是纳米材料影响ARGs变化的主要原因。对纳米体系中微生物胞外聚合物进行定量分析,结果表明胞外聚合物的增加有助于减缓纳米材料对抗生素抗性基因丰度的削减。(3)进行活性氧、胞外聚合物、溶出离子以及微生物生长抑制率对目标基因变化影响的权重分析(Variation partitioning analysis,VPA),结果显示微生物生长抑制率在所有变量中对ARGs变化的解释权重最大(22.44%);其次是离子溶出和活性氧,对基因变化的解释权重分别是15.63%和14.73%。结果表明纳米材料对微生物生长的抑制是造成抗性基因丰度降低的主要作用机制。(4)利用两种耐药纯菌株(粪产碱菌Alcaligenes faecalis和大肠杆菌Escherichia coli)进行纳米材料暴露实验,发现CuO NPs和ZnO NPs可明显降低粪产碱菌中目标抗性基因的丰度,但对大肠杆菌中目标抗性基因无明显影响,结果表明纳米材料可降低抗性基因丰度;但纳米材料的影响具有选择性,对特定微生物作用效果明显。本研究通过分析纳米材料对抗性基因的作用影响与机制,有助于了解纳米材料与抗生素抗性基因的环境效应,为新型污染物的环境效应及抗性基因扩散控制提供理论依据。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X703;TB383.1
【部分图文】：

纳米材料,尺寸大小,抗性基因

化过程[23]以及抑制微生物活性[24]等。但目前对环境渗滤液体系中抗性基因响尚未有研究报道。目前，关于纳米材料对环境污染源中抗性基因影响的研究较为缺乏，尚未明确纳米材料对抗性基因的影响规律及作用机制。虽然已有研究在纯菌体拟探究纳米材料对抗性基因的影响规律，但纳米材料对环境污染源中抗性及抗性基因的影响没有研究报道。本论文选取不同类型的纳米材料（纳米金属氧化物和碳纳米管），以垃圾填埋场的垃圾渗滤液中可培养微生物为象，探究纳米材料对环境污染源中抗性基因的影响及其作用机理。本研究析纳米材料对抗性基因的作用影响与机制，有助于了解纳米材料与抗生素因的环境效应，为新型污染物的环境效应及抗性基因扩散控制提供理论依1.2 纳米材料的性质、应用及其环境影响1.2.1 纳米材料的定义及类别

示意图,纳米材料,动物,途径

华东师范大学硕士学位论文高于水体和大气[59, 60]。人类的活动影响使得环境复杂污染源中存在大量纳米材料，如城市垃圾填埋场及其渗滤液[61-63]。然而存在于环境中的纳米材料会通过皮肤接触、吸入以及摄取三种主要途径对动植物造成潜在暴露危害[18]。图 1-3 为纳米材料对人类、动物及微生物的潜在暴露途径示意图。

水平转移,抗性基因,机制

图 1-4 抗性基因水平转移机制[88]Fig.1-4 Mechanism of horizontal gene transfer性基因具有易得难失的特点，虽然减少环境中抗生素浓度可以减缓选择到削减环境中耐药微生物的目的，但已存在环境中的抗性基因和基因转会一直维持稳定[10]。并且随着健康医疗和农业的发展需要，环境中抗将是前所未有的，环境中抗生素的选择压力会打破致病菌和抗生素之间衡，最终对人类健康和环境保护形成巨大挑战。3.2 垃圾渗滤液中抗生素抗性基因的存在与分布于填埋场处置大量的含有抗生素和抗性基因的固体物（如市政污泥、非弃物、以及过期或废旧个人护理和医药品等），使得城市垃圾填埋场成抗性基因主要污染源[14, 79, 90-92]。有研究调查了 12 个分布在中国六个不圾渗滤液中的抗性基因，发现样品中均存在测试的 5 种抗性基因（tebla、sul1 和 sul2）以及 7 种耐药异养微生物，其中抗性基因的丰度

【参考文献】