小黑杨PnCCH10基因的遗传转化及相关功能鉴定

发布时间：2020-09-30 14:45

　　 目前,由于植被利用及人为活动造成的土壤重金属污染日益严重,植物修复是改善重金属污染土壤环境的新兴技术。铜既是土壤重金属污染的主要污染物之一,又是植物维持正常生命活动所需的微量元素。为了适应环境中的铜水平,植物已经形成了复杂的调控网络以维持细胞铜稳态,铜伴侣蛋白是实现此机制的重要参与者。本研究在课题组前期工作的基础上,构建了小黑杨(Populus simonii×us nigra)铜伴侣蛋白基因PnCCH5、PnCCH10、PnCCH19的植物表达载体。利用构建的PnCCH10基因的表达载体,通过蘸花法遗传转化拟南芥野生型植株及cch突变体植株;通过农杆菌介导的叶盘法遗传转化小黑杨,分别获得了转PnCCH10基因的拟南芥和小黑杨植株,并进行了相关分子生物学和生理指标鉴定。主要研究结果如下:(1)利用已经克隆的小黑杨PnCCH5(MF977407.1)、PnCCH10(MF977410.1)和PnCCH19(MF977413.1)基因,通过酶切连接法构建了拟南芥过量表达载体pCAMBIA1302-PnCCHs,电击转化农杆菌菌株GV3101后获得了含有重组质粒的农杆菌菌株。同时,构建了 PnCCH5、PnCCH10及PnCCH19基因的小黑杨过量表达载体pROKII-PnCCHs,电击转化农杆菌菌株EHA105后获得了含有重组质粒的农杆菌菌株。(2)利用构建的PnCCH10基因的拟南芥过量表达载体,通过蘸花法遗传转化拟南芥野生型及cch突变体植株。利用潮霉素进行筛选并获得T2代植株。提取两种类型T2代转基因植株的基因组DNA,通过PCR方法鉴定后获得了 9个PnCCH10-WT转基因株系和10个PnCCH10-cch转基因株系。收取鉴定后的转基因植株纯合种子并保存。(3)利用构建的PnCCH10基因的小黑杨过量表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法遗传转化小黑杨野生型植株。利用含有卡那霉素的培养基进行筛选后获得阳性植株。提取阳性转基因植株的基因组DNA,利用特异性检测引物进行PCR鉴定,获得了 16个PnCCH10转基因小黑杨株系。利用qRT-PCR方法鉴定转基因株系中PnCCH10基因的表达情况,挑选出5个PnCCH10基因高表达的转基因株系进行生理指标测定。(4)利用含有正常浓度铜离子(0.5 μmol/L)和高浓度铜离子(10 μmol/L)的改良1/2霍格兰德营养液水培处理小黑杨野生型和转基因株系幼苗7 d。测定处理植株的丙二醛(MDA)含量,同时测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)酶活等生理指标。结果显示,正常浓度铜离子处理条件下,与野生型对照植株相比,2和13号转基因株系叶片MDA含量显著降低,5号株系根MDA含量显著升高;各转基因株系叶片和根SOD酶活显著升高;3、5、7、13号株系叶片和2、5、13号株系根的POD酶活显著降低;13号株系叶片和3、5、7、13号转基因株系根CAT酶活显著升高。过量铜胁迫处理后,与野生型植株相比,各PnCCH10过表达转基因株系MDA含量和SOD酶活无显著变化;除了7号株系根POD酶活无显著差异之外,其余各转基因株系叶片和根POD酶活均显著下降;除了 5号转基因株系叶片CAT酶活无显著差异之外,各转基因株系根CAT酶活显著降低,叶片CAT酶活显著升高。这些研究结果为进一步鉴定小黑杨PnCCH10蛋白的功能、丰富铜伴侣蛋白CCH在维持杨树细胞铜稳态过程中发挥的作用奠定了试验基础,为培育重金属耐受植物来修复土壤污染提供材料依据。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：X53;X173;Q943.2
【部分图文】：

以稀释邋５０邋倍的尸７７ＣＣ／／５－ｐＥＡＳＹ、／＾ＣＣ／／／（？－ｐＥＡＳＹ、尸／？ＣＣ７／／９－ｐＥＡＳＹ邋克隆质粒逡逑为模板，使用含有Ｗｃｏ邋Ｉ和５＾邋Ｉ的拟南芥表达载体引物进行ＰＣＲ，获得目的条带后进逡逑行ＰＣＲ产物回收纯化。琼脂糖凝胶电泳结果显示（图２－１），小黑杨Ｐ？ＣＣ／／５、逡逑ＰｔｔＣＣ／／川和基因的目的扩增条带长度分别为４５３、４９２、５３７邋ｂｐ，条带大小符逡逑合预期且条带单一，可以用于后续实验。逡逑Ｍ逦１逦２逦３逡逑—逡逑图２－１构建拟南芥表达载体目的基因的ＰＣＲ纯化产物逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；邋１：逦基因；２：乃７ＣＣ／／７０邋基因；３：邋Ｐ／７ＣＣ／／７９邋基因。逡逑以稀释邋５０邋倍的邋Ｐ？ＣＣ／／５－ｐＥＡＳＹ、尸ｗＣＣＺ／ｉＯ－ｐＥＡＳＹ、Ｐ？ＣＣ７／／９－ｐＥＡＳＹ邋克隆质粒逡逑－１２－逡逑

逑为模板，使用含有沿＾１和你酶切位点的小黑杨表达载体引物进行ＰＣＲ，获得目的逡逑条带后进行ＰＣＲ产物回收纯化。琼脂糖凝胶电泳结果显示（图２－２），小黑杨逡逑尸》ＣＣ／／５、Ｐ？ＣＣ／／７０和尸ｚ？ＣＣ／／／９基因的目的扩增条带大小符合预期。逡逑５００邋ｂｐ逡逑忍＇逦ｒ逦．逡逑图２－２构建小黑杨达载体目的基因的ＰＣＲ纯化产物逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；邋１：尸／７ＣＣ／／５邋基因；２：尸《0＾／７０邋基因；３：邋ＡＣＣ／Ｚ／Ｐ邋基因。逡逑２．３．２乃ｉＣＣＷｓ基因及质粒双酶切逡逑在含有Ｋａｎ的ＬＢ固体培养基上划线载体菌种，挑取单菌落，３７°Ｃ过夜扩大培养。逡逑利用质粒小提试剂盒提取ＰＣＡＭＢＩＡ１３０２及ｐＲＯＫＩＩ质粒。结果如图２－３所示。ｐＲＯＫＩＩ逡逑和ｐＣＡＭＢＩＡ〗３０２质粒提取效果良好，可以用于双酶切反应。逡逑Ｍ逦１逦Ｍ逦２逡逑１００００邋ｂｐ邋Ｉ邋１邋＇逡逑■■逡逑图邋２－３邋ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２邋和邋ｐＲＯＫＩＩ邋载体质粒逡逑Ｍ：邋ＤＬ１５０００Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２邋载体质粒；２：邋ｐＲＯＫＩＩ邋载体质粒。逡逑使用限制性内切酶＃ｃｏ邋Ｉ和Ｓｐｅ丨分别双酶切ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２质粒及含有酶切位点的逡逑／＾ＣＣ／／５、尸《ＣＯ／／０、Ａ？ＣＣ７／／９基因的ＰＣＲ纯化产物。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示逡逑－１３－逡逑

图２－４邋ＰＣＡＭＢＩＡ１３０２质粒的酶切结果逦图２－５邋ＰｎＣＣ历基因的酶切结果逡逑Ｍ：邋ＤＬ１５０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１：质粒酶切前；逦Ｍ：邋ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；邋１：尸《０：奶基因；２：逡逑２：质粒酶切后。逦办《：／／５基因酶切产物；３：邋ＰｎＣＣＺ／ｉＯ基因；４：逡逑户；７0：／／／０基因酶切产物；５：邋ＰｒｔＣＣ７／／９基因；逡逑６：邋Ｐ？ＣＣ／／／９基因酶切产物。逡逑使用限制性内切酶沿ｗ邋Ｉ和Ｉ分别双酶切ｐＲＯＫＩＩ质粒及含有酶切位点的逡逑／＾＜Ｘ７／＿５、乃７ＣＣn,、／＾ＣＯ／７９基因的ＰＣＲ纯化产物。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示逡逑（图２－６，２－７），ｐＲＯＫＩＩ质粒双酶切之后，目的条带与ＳＣ构型的原始质粒存在位移逡逑差，由此表明，载体酶切成功。ＡＣＯ／５、＾ＣＣＺ／川、Ｐ？ＣＣ扣９基因的ＰＣＲ纯化产物逡逑酶切后电泳迁移率与酶切之前无明显差异。逡逑Ｍ逦１逦２逦Ｍ邋１逦２逦３逦４逦５逦６逡逑

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本文编号：2830969