含铜绿假单胞菌外膜蛋白p仿生膜的制备及其在水处理中的应用研究

发布时间：2020-10-10 23:28

　　 水体中磷酸盐过量而造成的富营养化是水处理方面的一大难题。虽然人们提出了很多解决的方法,但往往会伴随着原料的不可回收、容易形成二次污染、处理效率低等问题的出现。随着膜分离技术被应用于磷酸盐污水处理之后以上这些问题被解决。近几年来,含蛋白仿生膜因其具有的特异的选择性和高效性而备受追捧。这也为我们将水体中磷酸盐的去除提供了新的方向。为了对水体中磷酸盐进行选择性吸附以及除去,本文在亲水性聚砜膜上构建了含铜绿假单胞菌外膜蛋白p的仿生膜并验证其在水处理方面的效果。1、在菌体培养方面,从温度、pH和磷酸盐浓度这三个方面进行优化。经过研究之后发现,菌体的35℃、pH 7.5以及磷酸盐的浓度为0.2 mM的条件下能够进行最好的生长于繁殖,菌体最大的OD值可以达到2.7。而磷酸盐浓度又对OprP表达量有很大的影响,所以我们对在不同磷酸盐浓度条件下培养的菌体进行蛋白的提取纯化,发现只有在磷酸盐浓度为0.1 mM时有明显的蛋白条带,说明菌体在磷酸盐浓度为0.1 mM时有大量的目的蛋白存在。由于目的蛋白表达的最佳磷酸盐浓度是0.1 mM,因此选择35℃、pH 7.5以及磷酸盐的浓0.1 mM的作为最终的菌体培养条件。2、探究了脂质体粒径均一性对蛋白插入量的影响,我们首先选择不同磷脂浓度、干燥方式以及水化超声时间对脂质体粒径均一性的影响进行验证。利用动态光散射对脂质体粒径进行测定发现不同磷脂浓度、干燥方式对脂质体粒径的均一性影响较小,而水化超声时间过长或者过短都会对脂质体粒径均一性产生较大的影响。利用透射电子显微镜对制备的脂质体进行观察,发现脂质体的粒径存在差异,这与动态光散射所检测到的粒径结果一致。我们选择对不同超声时间条件下产生的脂质体进行蛋白插入量的检测。水化超声时间为1 min时蛋白插入量最少,超声时间为5 min时蛋白插入量最多。这与脂质体粒径均一性的规律相统一。从而说明蛋白的插入与脂质体的粒径均一性相关。3、在含OprP仿生膜的支撑基底制备方面,我们选择制备亲水性的聚砜膜。选择共混添加不同量(0%,2%,4%,6%,8%,10%)的聚乙二醇来改变膜的亲水性。通过比较制备的聚砜膜的孔隙率、接触角、水通量以及截留率,我们发现含6%聚乙二醇的聚砜膜的性能最好。利用扫面电子显微镜对含聚乙二醇6%的聚砜膜进行表面形态观察,发现膜的表面孔径大小为200 nm左右圆形且成孔均匀,效果比较理想。4、探究组装成的含OprP仿生膜性能,主要从吸附、渗析和电渗析三个方面来验证它对磷酸盐的特异性吸附和去除方面的效果。在膜吸附方面,实验进行的五个小时内含OprP的仿生膜的实验装置中磷酸盐的浓度从6.3 mg/L降到5.53mg/L;在膜渗析方面,反应的5 h之内阳极室的磷酸盐浓度升高了约0.1 mg/L;说明传质的效率是十分低的,为了提高传质效率,接下来采用电渗析,在通电条件下磷酸盐的渗透率是非电压条件下的3倍左右,且在混合阴离子的条件下验证了含OprP的仿生膜能够对磷酸盐进行特异性选择。本文主要是在对组成仿生膜的三大主要成分进行制备,然后构建了含铜绿假单胞菌外膜蛋白p的仿生膜,并且证明它对能够对水体中磷酸盐进行吸附以及去除。仿生膜的构建是多学科交叉的技术,本研究对于解决磷酸盐水污染问题提供新的思路和方法,也将有助于该仿生膜技术的进一步的开发和应用。
【学位单位】：齐鲁工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ051.893;X703
【部分图文】：

第二章 含 OprP 铜绿假单胞菌培养条件的优化气泡的产生，然后插入梳子，待凝胶充分聚合约 35 min 后小心的将梳子取出来将提取出来的外膜膜蛋白样品与上样缓冲液以 4:1 的比例混合均匀，然后再在100 ℃的温度下进行 5 min 得反应以使蛋白变性，10000 g 作用力下离心 2 min取上清点样。将制备完成的胶玻璃板放入电泳槽中，然后加入电泳缓冲液至短玻璃板被完全淹没，用微量的移液枪取制备好的蛋白样品和 marker 加入样品孔中连接电源，把电压大小调到 80 V，当观察到指示剂进入分离胶层时，再把电压调到 120 V。当指示剂距离玻璃板底端 1 cm 时电泳结束，考马斯亮蓝染色脱色置凝胶成像系统观察拍照。2.3 结果与讨论2.3.1 不同温度条件对菌体生长量的影响

图 2.2 铜绿假单胞菌在不同 pH 下的菌体生长量与温度对铜绿假单胞菌菌体生长量的影响相同，pH 对铜绿假单胞菌在缺磷培养基上的生长至关重要 ，因此我们在最佳的温度条件下，进行了 pH 对铜绿假单胞菌菌体生长量的影响，结果如图 2.2 。在 pH 为 7.0 和 7.5 的条件下菌体能进行比较旺盛的生长繁殖，在两个 pH 值下菌体的生长量基本一致，pH7.0 的最大值达到 2.0 而 pH 7.5 却达到了 2.6，说明菌体在 pH 7.5 的条件下更具有生长的优势。这与研究铜绿假单胞的最适生长 pH 在 7.2 基本一致[24]。而在 pH 为 8.的条件下菌体的生长缓慢且不旺盛，是由于在碱性条件下，不利于菌体吸收外界营养成份，从而不能很好地进行菌体的生长和繁殖。所以在以后的菌体培养选择在 pH 7.5 的条件下进行。

图 2.3 铜绿假单胞菌在不同磷酸盐浓度下的菌体生长量铜绿假单胞菌只有在缺磷条件下才能表达我们所需的目的蛋白 OprP ，因此我们需要寻找适合菌体生长的磷酸盐浓度与菌体表达的缺磷条件相结合，从而选出最佳的磷酸盐浓度来获得最大量的目的蛋白 OprP。因此我们选在在不同的磷酸盐浓度下对菌体进行培养，所选择的磷酸盐浓度分别为 0.05 mM、0.1 mM、0.mM，它们对菌体生长的影响如图 2.3 所示。菌体在三个不同的磷酸盐浓度下都可以进行生长，且生长的规律一致。可以看出磷酸盐浓度越低菌体生长越缓慢2.3.4 外膜蛋白纯化的 SDS-PAGE 电泳分析
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本文编号：2835699