砷转运蛋白基因表达对微生物砷甲基化的影响

发布时间：2020-11-16 07:29

　　 砷污染已成为一个全球性问题。寻找行之有效的砷污染治理与修复方法一直是人们努力追求的目标与方向。微生物砷甲基化能将高毒无机As(III)转化为低毒和高挥发性甲基胂,被认为是一种环境砷污染修复的有效手段。然而,大多数微生物的砷挥发效率相对有限,难以达到应用目的。分析其原因,可能是微生物产生的砷转运蛋白降低了胞内砷含量,竞争性地限制了微生物的砷挥发效率,究竟是否如此,目前尚不明确。沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009是研究砷代谢机制的模式生物,但其砷挥发效率很低,基因组显示有2个砷外排基因,其表达蛋白将砷排出胞外可能是限制微生物砷甲基化反应的主要原因。为了证明这一假设,本研究首先建立了响应胞内砷浓度的生物传感器,旨在通过监测胞内砷含量的高低,比较了不同来源砷外排蛋白的活性及其对砷甲基化的影响;进一步通过敲除CGA009菌株2个砷外排基因,研究了砷外排蛋白对砷甲基化的影响。主要研究结果如下:(1)插件式生物传感器建立和砷外排蛋白活性的比较。以Escherichia coli BL21(DE3)的砷抗性操纵子(Pars、arsR、arsB和arsC)为基础,以绿色荧光蛋白基因(gfp)为报告基因,砷敏感菌株E.coli AW3110(DE3)(?arsRBC)为宿主,构建了响应胞内砷浓度的插件式砷生物传感器系统(B系统)。以E.coli BL21(DE3)的ArsB_(EC)为对照,比较了源于CGA009的2种砷外排蛋白(ArsBRP/Acr3RP)的外排活性。结果表明:荧光强度与As(III)浓度(0~2.0μmol/L)呈良好的线性关系,As(III)浓度升高,GFP荧光强度升高;砷外排蛋白活性越高,细胞内砷含量则越低,则荧光强度也越低;这3种砷外排蛋白的活性顺序为ArsB_(RP)ArsB_(EC)Acr3_(RP),与砷抗性实验测定的活性顺序一致。本研究提供了一种比较砷外排蛋白活性的方法,与经典抗性测定的方法相比,该方法线性关系更好、灵敏度更高、砷用量少,操作更安全。(2)砷外排蛋白对微生物砷甲基化的限制作用。将源于CGA009的砷甲基化酶基因(arsM)与B系统中不同砷外排基因元件共表达,构建砷生物传感器系统(BM系统),通过As(III)抗性测定、荧光检测、HPLC-ICP-MS砷形态分析和总砷含量测定,研究不同砷外排蛋白对微生物砷甲基化的影响。结果表明:砷外排蛋白活性越高,微生物砷抗性越高,GFP荧光强度越低,微生物砷甲基化和砷挥发效率越低;在100.0μmol/L As(III)孵育12 h时,与无砷外排基因的重组菌的砷挥发能力(10.01%)相比,arsB_(RP)、arsB_(EC)和acr3_(RP)分别与arsM共表达的重组菌的砷挥发能力为3.99%、5.65%和8.20%。由此可见,砷外排基因与砷甲基化基因共表达时,砷外排蛋白将胞内砷外排,限制了微生物砷甲基化能力。(3)基因敲除砷外排基因对微生物砷甲基化的影响。本研究分别敲除CGA009中砷外排基因arsB_(RP)和acr3_(RP),得到了?arsB_(RP)和?acr3_(RP)P 2个缺失突变株。对As(III)与As(V)抗性大小顺序为野生株?arsB_(RP)?acr3_(RP)。在100μmol/L As(III)孵育12 h,砷挥发率大小顺序为野生株(0.49%)?arsB_(RP)(3.61%)?acr3_(RP)(5.13%);25.0μmol/L As(V)孵育12 h,砷挥发率大小顺序为野生株(0.59%)?arsB_(RP)(4.25%)?acr3_(RP)(6.08%)。在As(III)挥发体系中,野生株和突变株均检测低剂量的MAs(V)和DMAs(V),As(III)残留含量高低顺序为:野生株?arsB_(RP)?acr3_(RP)。由此可见,砷外排蛋白限制了微生物的砷甲基化,敲除砷外排基因可提高微生物砷甲基化效率,获得了一株砷挥发能力较高的突变株(?acr3_(RP))。基因敲除研究表明:砷外排蛋白活性大小为Acr3_(RP)arsB_(RP),与砷生物传感器(B系统)研究的活性的顺序不一致,其可能的原因是这2个外排蛋白在CGA009中位于不同的砷操纵子中,其表达量差异造成的。综上,本研究建立了一种响应胞内砷浓度变化的插件式生物传感器,首次比较了不同砷外排蛋白的活性,以及砷外排蛋白表达对微生物砷甲基化的影响。砷外排蛋白表达是限制微生物砷甲基化效率的重要遗传因素之一,敲除砷外排基因可显著提高微生物砷甲基化效率。本研究解释了微生物砷甲基化效率低的一种原因,为选育高挥发性能微生物提供了有效策略。
【学位单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;X172
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩略词对照表
第1章 绪论
    1.1 砷污染与危害
        1.1.1 砷的分布与来源
        1.1.2 砷的形态与毒性
        1.1.3 砷污染及现状
        1.1.4 砷污染治理
    1.2 微生物的砷代谢研究
        1.2.1 As（III）氧化
        1.2.2 As（V）还原
        1.2.3 砷甲基化
        1.2.4 砷脱甲基化
        1.2.5 砷外排
    1.3 砷甲基化微生物在环境修复中的应用
    1.4 不产氧光合细菌砷代谢研究
    1.5 目前研究存在的问题、研究内容及创新性
第2章 生物传感器法比较砷外排蛋白的活性
    2.1 材料和方法
        2.1.1 菌株、质粒和培养条件
        2.1.2 主要试剂与仪器
        2.1.3 表达砷外排基因的重组菌的构建与鉴定
        2.1.4 砷转运蛋白系统发育树的构建
        2.1.5 表达砷外排基因的重组菌的砷抗性测定
        2.1.6 表达砷外排基因的重组菌的荧光强度测定
        2.1.7 表达砷外排基因的重组菌的砷形态测定
    2.2 结果
        2.2.1 微生物砷转运蛋白的系统发育分析
        2.2.2 质粒的提取与砷外排基因的扩增
        2.2.3 重组载体pUC19-Pars-gfp-arsRB/（acr3）C克隆和鉴定
        2.2.4 表达砷外排基因的重组菌的构建与鉴定
        2.2.5 表达砷外排基因的重组菌的砷抗性比较
        2.2.6 表达砷外排基因的重组菌胞内砷含量分析
        2.2.7 表达砷外排基因的重组菌的砷形态分析
    2.3 讨论
    2.4 小结
第3章 生物传感器法研究砷外排蛋白对微生物砷甲基化的影响
    3.1 材料和方法
        3.1.1 试剂与仪器
        3.1.2 PCR扩增arsM基因
        3.1.3 共表达arsB/acr3与arsM的重组菌的构建与鉴定
        3.1.4 共表达arsB/acr3与arsM的重组菌的砷抗性测定
        3.1.5 共表达arsB/acr3与arsM的重组菌的荧光测定
        3.1.6 共表达arsB/acr3与arsM的重组菌的砷挥发能力测定
        3.1.7 共表达arsB/acr3与arsM的重组菌的砷形态测定
    3.2 结果
        3.2.1 arsM基因的克隆与检测
        3.2.2 共表达arsB/acr3与arsM的重组菌的构建与鉴定
        3.2.3 共表达arsB/acr3与arsM的重组菌的砷抗性比较
        3.2.4 共表达arsB/acr3与arsM的重组菌的荧光强度比较
        3.2.5 共表达arsB/acr3与arsM的重组菌的砷挥发能力的测定
        3.2.6 共表达arsB/acr3与arsM的重组菌的砷形态分析
    3.3 讨论
    3.4 小结
第4章 砷外排蛋白基因敲除对微生物砷甲基化的影响
    4.1 材料与方法
        4.1.1 质粒、菌株和试剂
        4.1.2 设计引物
        4.1.3 PCR扩增目的基因
        4.1.4 重组菌E.coli（pJQ200SK-arsBRP/（acr3RP）UD）的构建与鉴定
        4.1.5 自杀质粒的接合转移
        4.1.6 砷外排基因的敲除与鉴定
        4.1.7 基因缺失突变株砷抗性的测定
        4.1.8 基因缺失突变株砷挥发能力的测定
        4.1.9 基因缺失突变株对砷转化的测定
    4.2 结果
        4.2.1 基因组DNA与质粒的提取和目的基因扩增
        4.2.2 自杀载体的构建与鉴定
        4.2.3 砷外排基因缺失突变株的筛选和鉴定
        4.2.4 砷外排基因缺失突变株的生长活性比较
        4.2.5 砷外排基因缺失突变株砷抗性的比较
        4.2.6 砷外排基因缺失突变株砷挥发能力的比较
        4.2.7 砷外排基因缺失突变株砷形态的分析
    4.3 讨论
    4.4 小结
第5章 结论和展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
附录A 相关试剂的配制
附录B 基因敲除原理图与砷代谢相关基因汇总
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

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本文编号：2885798