废弃钻井泥浆降解细菌遗传多样性研究及两株降解细菌新种的确定

发布时间：2017-09-21 22:00

  本文关键词：废弃钻井泥浆降解细菌遗传多样性研究及两株降解细菌新种的确定

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【摘要】：石油天然气是重要的化石能源,然而在油气田的钻探开采过程中会产生有大量钻井泥浆,这些钻井泥浆因成分复杂,有机污染物含量高,难以自然降解,排放在环境中会造成严重的污染。微生物修复因具有成本低、无污染、高效率等优点,在废弃钻井泥浆治理方面具有广泛的应用前景。本论文以分离自3种不同泥浆体系的36株降解细菌为材料,通过BOX-PCR、16S rDNA PCR-RFLP和16S rRNA基因序列系统发育分析,研究了泥浆降解细菌的遗传多样性和系统发育地位；进而筛选出优势降解菌,并对优势菌株的降解特性及其对柴油的代谢产物进行了初步研究。采用形态学特征、生理生化特征、全细胞组分分析、16S rRNA基因和gyrB基因序列系统发育分析,以及DNA同源性分析等方法,确定了降解菌JH2和JHZ4的分类地位。研究结果如下：(1)废弃钻井泥浆中降解菌具有丰富的遗传多样性。BOX-PCR指纹图谱分析将36株降解菌分成了5个群；16S rDNA PCR-RFLP分析中,供试菌株形成了18种16SrDNA遗传图谱类型,表明了废弃钻井泥浆中的降解菌具有丰富的遗传多样性。选取了15株代表菌测定16S rRNA基因全序列,并构建系统发育树以分析系统发育地位。结果显示,泥浆降解细菌分别属于芽孢杆菌属(Bacillus),盐单胞菌属(Halomonas),假单胞菌属(Pseudomonas), Sinobaca菌属、Belliella菌属以及根瘤菌属(Rhizobium) 6个属,其中芽孢杆菌为优势菌。(2)在实验室条件下,代表菌株均能有效去除废弃泥浆的COD,降解柴油能力较强。其中,JH2菌株的降解效果最佳,处理7d后,钻井泥浆中COD去除率达60.5%,对柴油降解率达50%。实验结果显示,当接种量逐步增加时,JH2菌株对钻井泥浆中COD和柴油的降解率也随之增加,在接种量为10%时,降解率最高。而且菌株JH2对环境pH具有较好的适应性,在pH7.0和pH9.3条件下,JH2菌株均能很好地降解泥浆中COD和柴油。JH2能以柴油为惟一碳源生长,GC-MS结果显示,JH2可快速地将柴油中C10-C27直链烷烃和支链烷烃分解为小分子物质。(3)采用多相分类技术,确定了两株潜在细菌新种的分类地位。JHZ4~T为兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌,主要的脂肪酸(10%)种类为anteiso-C15:0, C-11:0 iso 30H和iso- C16:0,(G+C)mol%为50.4%(Tm)。与Paenibacillus amylolyticusDSM11747T, Paenibacillus xylanexedens DSM 21292T和Paenibacillus tundrae DSM21291T的16S rRNA基因序列相似性为分别为98.6%,98.2%和98.1%。与类芽孢杆菌属(Paenibacillus)菌株的gyrB基因序列相似性均小于85%；与Paenibacillus amylolyticus DSM 11747T, Paenibacillus tundrae DSM 21291T及Paenibacillus xylanexedens DSM 21292T的DNA-DNA杂交率分别为32.4%±1.6,39.3%±0.6和4.9%±0.8。最终将该菌株命名为Paenibacillus qionglaiensis JHZ4~T。JH2~T为严格好氧的革兰氏阳性球菌,主要脂肪酸(10%)为anteiso-C15:0和anteiso-C17:0,(G+C) mol%为49%(Tm)。与Sinobaca qinghaiensis DSM 17008T的16SrRNA基因序列相似性为98.9%,gyrB基因系列相似性为87.8%,DNA-DNA杂交率为40.3%±1.6。综上,将该菌株命名为Sinobaca bifengensis JH2~T。
【关键词】：废弃泥浆 降解菌 多相分类 类芽孢杆菌 Sinobaca
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X741;X172
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 文献综述10-22
• 1.1 引言10-11
• 1.2 废弃钻井泥浆研究进展11-14
• 1.2.1 废弃钻井泥浆11
• 1.2.2 废弃钻井泥浆的危害11
• 1.2.3 废弃钻井泥浆治理进展11-12
• 1.2.4 废弃钻井泥浆的生物处理12-14
• 1.3 细菌多样性研究方法14-16
• 1.3.1 经典分类法14-15
• 1.3.2 基于PCR技术的分类方法15-16
• 1.4 细菌新种鉴定16-20
• 1.4.1 传统分类方法17-18
• 1.4.2 分子生物学分类法18-20
• 1.5 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的分类现状20
• 1.6 Sinobaca菌属的分类现状20
• 1.7 本研究立题依据及主要研究内容20-22
• 1.7.1 立题依据20-21
• 1.7.2 研究内容21-22
• 第二章 不同体系废弃钻井泥浆高效降解菌遗传多样性研究22-31
• 2.1 材料与方法22-25
• 2.1.1 试验菌株22
• 2.1.2 DNA的提取22-23
• 2.1.3 BOX-PCR指纹图谱分析23
• 2.1.4 16S rDNA PCR-RFLP分析23-24
• 2.1.5 代表菌株16S rRNA基因序列测定24
• 2.1.6 数据处理24-25
• 2.2 结果分析25-29
• 2.2.1 BOX-PCR指纹图谱分析25-26
• 2.2.3 16S rDNA PCR-RFLP结果分析26-28
• 2.2.4 16S rRNA基因系统发育分析28-29
• 2.3 讨论29-31
• 第三章 废弃钻井泥浆高效降解菌筛选及降解特性研究31-39
• 3.1 材料与方法31-33
• 3.1.1 供试材料31
• 3.1.2 泥浆基础理化性质测定31
• 3.1.3 优势降解菌的筛选31-32
• 3.1.4 不同条件下降解菌降解效果测定32
• 3.1.5 优势菌株对柴油代谢降解产物的测定32-33
• 3.1.6 数据处理33
• 3.2 结果分析33-37
• 3.2.1 钻井泥浆基本特性33
• 3.2.2 优势菌株的筛选33-35
• 3.2.3 不同条件下降解菌的降解效果35-36
• 3.2.4 JH2降解柴油的中间产物分析36-37
• 3.3 讨论37-39
• 第四章 两株废弃钻井泥浆降解细菌新种的确定39-64
• 4.1 材料与方法39-48
• 4.1.1 供试菌株39
• 4.1.2 表型特征分析39-44
• 4.1.3 脂肪酸成分测定44-45
• 4.1.4 16S rRNA基因序列测定45
• 4.1.5 gyrB基因序列测定45-46
• 4.1.6 DNA同源性分析和菌株G+C mol%含量测定46-48
• 4.1.7 数据处理48
• 4.2 结果与分析48-62
• 4.2.1 JHZ4分类地位确定48-57
• 4.2.2 JH2分类地位确定57-62
• 4.3 讨论62-64
• 第五章 结论与建议64-66
• 5.1 结论64-65
• 5.2 进一步研究建议65-66
• 参考文献66-76
• 致谢76-77
• 附录：部分培养基及试剂配方77

【参考文献】

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本文编号：897077