基于RNA-Seq技术的三种抗抑郁药对斑马鱼胚胎的早期毒性效应研究

发布时间：2017-09-22 02:00

  本文关键词：基于RNA-Seq技术的三种抗抑郁药对斑马鱼胚胎的早期毒性效应研究

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【摘要】：在全球范围内,抗抑郁药在药物与个人护理用品(pharmaceutical and personal care products,PPCPs)中占有很高的比例,且在医疗行业中得到大量使用。但由于过量使用及随意丢弃等原因,使得抗抑郁药大量的进入环境中,国内外有很多文献报道了抗抑郁药在各类环境中的存在情况,特别是在水环境中的普遍存在,包括城市污废水、饮用水、地表水及地下水,此外还有研究表明抗抑郁药能大量富集在有机生物体中,故其对水生生物的毒性效应问题成为生态毒理研究的焦点。阿米替林、氟西汀和米安色林分别为三环类、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂类和四环类抗抑郁药中的典型药物,在水环境中均能被检测到。本论文以模式生物斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,阿米替林、氟西汀和米安色林为目标药物,利用转录组高通量测序(RNA-Seq)技术和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,开展环境相关浓度的三种抗抑郁药短期暴露下对斑马鱼胚胎及幼鱼的早期毒性效应研究。其主要结果如下:(1)环境污染水平下的抗抑郁药(0.1μg/L阿米替林,10μg/L氟西汀和10μg/L米安色林)分别对斑马鱼胚胎短期(120 h)暴露后,对斑马鱼胚胎及幼鱼的死亡率,斑马鱼胚胎的孵化率并没有显著性的影响,但抗抑郁药暴露组的斑马鱼平均体长受到了明显的抑制。这表明环境相关浓度下的抗抑郁药短期暴露可显著影响斑马鱼早期的发育。(2)利用Illumina Hiseq 2500测序平台分别对空白对照组和三组抗抑郁药暴露组的斑马鱼RNA样品测序后,按照有参考基因组的数据分析方法对测序结果进行了分析,质控后分别获得15,557,465、14,979,480、13,716,939和15,450,283个Clean Reads数,与参考序列的比对效率高达77%,此外,测序结果的饱和度很高,基本完全覆盖样品中所有表达的基因;通过对RNA-Seq结果中基因表达量的分析,可获得每个处理样品和空白对照样品之间的显著性差异表达基因,其中阿米替林32个,氟西汀34个,米安色林130个,在每组差异表达基因中,上调基因个数分别为7、22和64个,下调基因个数分别为25、12和66个;米安色林暴露组得到的差异表达基因数目最多,其中有部分基因能够被显著性注释到GO分类条目和KEGG通路中,在GO分类中主要参与应对化学刺激的反应过程、蛋白质水解过程和多种酶活性的改变,在KEGG通路中主要参与新陈代谢途径如柠檬酸(TCA)循环和胰岛素信号通路等,表明四环类抗抑郁药米安色林可能通过对相关基因在转录水平上的调控对斑马鱼胚胎产生毒性效应。(3)利用RNA-Seq测序剩余的RNA样品进行qRT-PCR分析,结果表明所挑选的15个差异表达基因在qRT-PCR中的表达量变化结果与RNA-Seq的结果基本吻合,且结果之间具有较好的相关性,表明RNA-Seq测序数据和分析结果准确可信。此外,在环境相关浓度下的抗抑郁药(0.1,1,10μg/L的阿米替林、氟西汀和米安色林)分别对斑马鱼胚胎的短期(120 h)暴露后,利用qRT-PCR技术从基因水平研究了前列腺素D2合成酶基因(ptgdsb),双特异性磷酸酶基因(dusp5),生物钟相关基因nr1d1,per2,早期生长反应蛋白基因egr1和egr4共6个差异表达基因在空白对照组和抗抑郁药暴露组间表达量变化的浓度效应关系,结果显示,抗抑郁药的短期暴露可导致这6个基因的表达受到抑制,暗示抗抑郁药可能通过影响斑马鱼的神经系统和生殖系统而抑制ptgdsb的表达,或通过降低dusp5的表达促进斑马鱼细胞的凋亡;此外,抗抑郁药还可能通过抑制nr1d1和per2的表达改变斑马鱼的生理节律状况,或通过改变早期生长反应蛋白基因egr1和egr4的表达从而对斑马鱼的早期发育产生毒性效应。综上,本论文的研究结果揭示了三种不同类型的抗抑郁药污染物的短期水体暴露对斑马鱼胚胎的早期生长发育都具有显著的毒性效应。三种抗抑郁药对斑马鱼胚胎的毒性效应具有一定的相似性,表现在显著的抑制斑马鱼幼鱼的体长,调控幼鱼体内相关基因的转录水平,暗示低剂量抗抑郁药类污染物的水体长期暴露可能影响鱼类早期胚胎的神经系统和生殖系统发育及其生理节律,从而对鱼类的个体发育以及种群发展产生一定的毒害效应。因此,本论文研究结果为评价药物类新型有机污染物对水生生物的毒性效应与机理提供了充足的证据,也提示我们水体中药物类污染物的生态毒性和风险问题亟待重视。
【关键词】：抗抑郁药 斑马鱼胚胎 RNA-Seq 差异表达基因 生态毒性
【学位授予单位】：上海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X171.5
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 绪论14-31
• 1.1 抗抑郁药概述14-17
• 1.1.1 抗抑郁药的使用现状14-15
• 1.1.2 抗抑郁药种类15-17
• 1.2 阿米替林、氟西汀和米安色林概述17-21
• 1.2.1 阿米替林、氟西汀和米安色林简介17
• 1.2.2 阿米替林、氟西汀和米安色林在环境中的分布17-21
• 1.3 阿米替林、氟西汀和米安色林的生物毒性研究现状21-22
• 1.3.1 行为及生殖能力21
• 1.3.2 神经及内分泌系统21-22
• 1.3.3 免疫系统22
• 1.4 RNA-Seq技术22-26
• 1.4.1 测序技术的发展历程23
• 1.4.2 RNA-Seq技术概述23-25
• 1.4.3 RNA-Seq技术在差异表达基因研究方面的优势25-26
• 1.5 研究目的与意义26-27
• 1.5.1 斑马鱼的选取26
• 1.5.2 本研究的目的和意义26-27
• 1.6 研究内容和技术路线图27-30
• 1.7 课题来源30-31
• 第二章 抗抑郁药暴露对斑马鱼胚胎生长发育指标的影响31-45
• 2.1 材料与方法31-36
• 2.1.1 主要仪器与设备31-32
• 2.1.2 主要药品及试剂32
• 2.1.3 实验动物及饲养条件32
• 2.1.4 实验设计32-33
• 2.1.5 样品采集33
• 2.1.6 总RNA提取33-36
• 2.1.7 数据处理36
• 2.2 实验结果与讨论36-44
• 2.2.1 斑马鱼胚胎发育情况36
• 2.2.2 斑马鱼胚胎孵化率36-37
• 2.2.3 斑马鱼胚胎存活率37-38
• 2.2.4 斑马鱼幼鱼体长38-40
• 2.2.5 斑马鱼幼鱼RNA样品40-44
• 2.3 本章小结44-45
• 第三章 斑马鱼胚胎在抗抑郁药暴露后的RNA-Seq分析45-65
• 3.1 实验流程及分析方法45-50
• 3.1.1 RNA-Seq测序实验流程45-46
• 3.1.2 测序数据质量控制46-47
• 3.1.3 RNA-Seq数据与参考基因组序列比对47
• 3.1.4 RNA-Seq文库质量评估47-48
• 3.1.5 基因表达量分析48
• 3.1.6 差异表达基因筛选分析48-49
• 3.1.7 差异表达基因GO分类49
• 3.1.8 差异表达基因KEGG注释49-50
• 3.2 实验结果与讨论50-63
• 3.2.1 测序数据及其质量控制50-51
• 3.2.2 RNA-Seq数据与参考基因组序列比对51-53
• 3.2.3 RNA-Seq文库质量评估53-55
• 3.2.4 基因表达量分析55-57
• 3.2.5 差异表达基因筛选分析57-61
• 3.2.6 差异表达基因GO分类61-63
• 3.2.7 差异表达基因KEGG注释63
• 3.3 本章小结63-65
• 第四章 RNA-Seq差异表达基因的验证及分析65-91
• 4.1 材料与方法65-73
• 4.1.1 主要仪器与设备65
• 4.1.2 主要药品及试剂65-66
• 4.1.3 实验动物及饲养条件66
• 4.1.4 实验设计66
• 4.1.5 样品采集66
• 4.1.6 总RNA提取66-68
• 4.1.7 cDNA模板合成68
• 4.1.8 基因引物验证68-72
• 4.1.9 抗抑郁药暴露后基因qRT-PCR分析72-73
• 4.1.10 数据处理73
• 4.2 实验结果与讨论73-90
• 4.2.1 斑马鱼胚胎或幼鱼生理指标73-74
• 4.2.2 斑马鱼幼鱼RNA样品74-75
• 4.2.3 目的基因引物验证75-80
• 4.2.4 RNA-Seq测序结果中差异表达基因的验证80-85
• 4.2.5 抗抑郁药暴露对斑马鱼幼鱼的毒性评价85-90
• 4.3 本章小结90-91
• 第五章 结论与展望91-94
• 5.1 研究结论91-92
• 5.2 研究展望92-94
• 参考文献94-102
• 参与课题与科研成果102-104
• 致谢104-105

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