G-四链体DNA酶催化鲁米诺化学发光在钾离子、铅离子分析中的应用

发布时间：2017-04-01 21:04

  本文关键词：G-四链体DNA酶催化鲁米诺化学发光在钾离子、铅离子分析中的应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：以化学反应为基础的化学发光分析法因具有无背景散射光干扰、灵敏度高、分析速度快、线性范围宽,同时仪器设备简单、廉价、易微型化等独特的优点在无机物、有机物的痕量和超痕量分析领域得到了广泛的应用。其中鲁米诺发光体因具有较高的发光量子产率和较好的水溶性,是目前研究及应用最为广泛的一类化学发光试剂,而近年来传统的鲁米诺-双氧水发光体系常使用的催化剂有辣根过氧化酶(HRP)、金纳米材料、金属硫族纳米材料、碳纳米材料。然而HRP这类天然蛋白酶本身不稳定易失活且其修饰难度较大,而上述纳米材料也不易修饰,限制了这些纳米材料在鲁米诺化学发光体系中的分析应用。G-四链体DNA酶(G-quadruplex DNAzyme)作为一种新型的DNA酶,近几年来受到了研究者的广泛关注。这种人工酶具有类似于过氧化物酶的催化功能,在生理条件下,易功能化,且性能稳定,在纳米元件和生物传感器的构建中得到了重要的应用,可以取代传统的蛋白酶HRP,实现对目标分子的信号放大检测。目前,已报道的G-四链体DNA酶的分析应用大多是用于催化双氧水介导的氧化还原反应,例如3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨(ABTS)、鲁米诺等,但是相较于前两者,在鲁米诺-双氧水化学发光反应中的应用具有一定的局限性。本文的创新之处是利用钾离子(K+)和铅离子(Pb2+)的核酸适配子形成的G-四链体DNA酶结合高灵敏度的化学发光技术,实现了对K+和pb2+的高灵敏检测,并且成功用于生物实际样的测定。进一步扩大了化学发光的分析应用范围,为化学发光在生化分析领域发展了新的检测方法。具体内容包括以下三个方面：(1)对K+的高灵敏检测通过引入K+诱导的G-四链体DNA酶增强化学发光,同时以K+为检测目标,开发了一种基于脱氧核酸酶的高灵敏的K+化学发光分析方法。研究发现,与其他金属离子相比,只有K+能使核酸探针形成平行的G-四链体结构,从而与血晶素(hemin)发生较强的结合,形成具有较强催化功能的DNA酶,显著增强了化学发光。结果表明,化学发光增强的程度与K+的浓度在2-120μM之间呈良好的线性关系,检测限为1.66μM。该方法灵敏度高、选择性好,通过选择合适的探针或者生物大分子,能够进一步用于其它靶标的检测。(2)对Pb2+的高灵敏检测由于pb2+与上述DNA形成的G-四链体结合常数大于K+与G-四链体的结合常数,并且Pb2+诱导DNA形成的是反平行的G-四链体,与hemin的结合能力很弱,不能得到G-四链体DNA酶。故在K+稳定的平行G-四链体中引入pb2+,能诱导平行的G-四链体构象发生变化而形成反平行的G-四链体,从而降低化学发光的强度。结果表明,其降低的程度与Pb2+的浓度的对数成线性关系,检测限为0.06 nM,线性范围是0.4-10 nM。该方法灵敏度高,并且成功用于头发实际样中Pb2+含量的检测。(3)钾-铅调控的DNA逻辑门由于K+和pb2+分别诱导形成不同构象的DNAG-四链体,导致DNA酶的催化能力不同,K+诱导的DNA酶能显著增强化学发光,pb2+诱导的DNA酶没有增强化学发光的功能。将K+和Pb2+作为两个输入信号,化学发光作为输出信号,构建一个双输入INHIBIT逻辑门。该逻辑门的建立能为化学发光法同时分析检测K++和Pb2+设计计算程序提供参考。通过以上研究,我们成功的利用K+和pb2+诱导的G-四链体DNA酶发展了高灵敏检测K+和Pb2+的方法,开拓了DNA酶在化学发光分析检测方面的应用,丰富了化学发光分析检测对象,为更多的生物标志物提供更加灵敏的检测方法。
【关键词】：G-四链体 DNA酶 化学发光 钾离子 铅离子 逻辑门
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：O657.3
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 缩写符号对照表12-13
• 第1章 选题依据13-25
• 1.1 研究意义13-15
• 1.2 国内外研究现状及发展动态分析15-22
• 1.2.1 G-四链体DNA酶的结构与性质16
• 1.2.2 G-四链体构型的多态性16-17
• 1.2.3 G-四链体DNA酶在分析化学中的应用17-22
• 1.3 存在的主要问题22
• 1.4 本研究的目标、内容及拟解决的问题22-23
• 1.4.1 研究目标22
• 1.4.2 研究内容22-23
• 1.4.3 拟解决的问题23
• 1.5 研究方案及可行性分析23-24
• 1.5.1 研究方案23-24
• 1.5.2 可行性分析24
• 1.6 特色与创新24-25
• 第2章 K~+导的的G-四链体DNA酶催化化学发光高选择性检测K~+25-33
• 2.1 引言25-26
• 2.2 实验部分26-27
• 2.2.1 仪器26
• 2.2.2 试剂和药品26
• 2.2.3 实验方法26-27
• 2.3 结果与讨论27-31
• 2.3.1 K~+诱导DNA酶对鲁米诺化学发光的增强27-28
• 2.3.2 实验条件优化28
• 2.3.3 K~+灵敏检测28-29
• 2.3.4 选择性考察29
• 2.3.5 人尿液中K~+的测定29-30
• 2.3.6 G-四联体-hemin DNA酶的构象表征30-31
• 2.4 本章小结31-33
• 第3章 Pb~(2+)替代G-四链体DNA酶中的K~+催化化学发光高灵敏检测Pb~(2+)33-41
• 3.1 引言33-34
• 3.2 实验部分34-35
• 3.2.1 仪器34
• 3.2.2 试剂和药品34
• 3.2.3 实验方法34-35
• 3.3 结果与讨论35-39
• 3.3.1 Pb~(2+)诱导的DNA酶对鲁米诺-双氧水的化学发光增强35-37
• 3.3.2 实验条件的优化37-38
• 3.3.3 Pb~(2+)化学发光法的灵敏度和选择性38-39
• 3.4 本章小结39-41
• 第4章 K~+Pb~(2+)调控的G-四链体DNA酶催化化学发光强信号的DNA逻辑门41-47
• 4.1 引言41
• 4.2 实验部分41-42
• 4.2.1 仪器41-42
• 4.2.2 试剂和药品42
• 4.2.3 实验方法42
• 4.3 结果与讨论42-45
• 4.3.1 构建逻辑门DNA的选择42-43
• 4.3.2 K~+和Pb~(2+)双输入INHIBIT DNA逻辑门43-44
• 4.3.3 Pb~(2+)和EDTA双输入的IMPLICATION DNA逻辑门44-45
• 4.4 本章小结45-47
• 第5章 全文总结及展望47-49
• 5.1 总结47
• 5.2 展望47-49
• 参考文献49-57
• 硕士期间科研成果57-59
• 致谢59

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