广西六堡茶化学成分分离、活性分析及茶褐素提取工艺研究

  本文关键词：广西六堡茶化学成分分离、活性分析及茶褐素提取工艺研究，由笔耕文化传播整理发布。

广西师范学院硕士学位论文

第二章 六堡茶不同萃取物的生理活性研究

本章节主要是针对广西六堡茶不同萃取极性部分进行活性探究。通过文献可知黑茶本身含有对人体有保健作用的功能性成分，六堡茶属于黑茶之一，因此我们对其萃取后各极性部分进行活性测定。主要分为三部分，分别是测定抗氧化活性、抗菌活性以及抗肿瘤活性。期望通过实验判定广西六堡茶中的活性，然后根据其活性值进行提取分离，探究其所含化学成分。实验中所用茶叶由广西梧州茶厂提供。

2.1 实验仪器和试剂

2.1.1 仪器设备

表2-1 实验所用主要仪器

Table 2-1 Main Instrument for Experiment

仪器名称

标准筛

水浴锅

循环水式多用真空泵

酶标仪

立式压力蒸汽灭菌器

离心机

电热恒温干燥箱

高速台式冷冻离心机

显微镜

调速多用振荡器

电子天平

CO2培养箱

自动三重纯水蒸馏器

旋转蒸发仪

超声波清洗机

手提式高速中药粉粹机

厂家 上虞市五四仪器厂 郑州长城科工贸有限公司 郑州长城科工贸有限公司 Thermo Scientific Company 上海申安医疗器械厂 湖南湘仪仪器开发有限公司 上海跃进医疗器械厂 上海安亭科学仪器厂 OLYMPUS,JAPAN 国华电器有限公司 上海梅特勒-托利多有限公司 SANYO Electric CO.,LTD. 上海亚荣生化仪器厂 郑州长城科工贸有限公司 巩义予华仪器有限责任公司 温岭市林大机械有限公司 型号 孔径0.600mm, 60目 WB-2000 SHB-III MLLTISKAN MK3 LDZX-50FB L-535R GZX-DH-400-S-II TGL-16G-C IX2-SLP HY-2 EL-204 INCUBATOR TU-1901 SZ-97A R-1001N KQ-400B DFT-100 双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司

广西六堡茶化学成分分离、活性分析及茶褐素提取工艺研究

2.1.2 实验试剂

表 2-2 实验所用主要试剂

Table 2-2 Main Reagent for Experiment

试剂名称

Vc

MTT

Tris

DPPH

DMSO

芦丁

石油醚

正丁醇

乙酸乙酯

95%乙醇

H2O2溶液

无水乙醇

邻苯三酚

邻二氮菲

盐酸溶液

PBS缓冲液

胰酶工作液

细胞冻存液

硫酸亚铁溶液

10%胎牛血清

F-12培养基

RPMI 1640培养基

普通营养肉汤

胰蛋白胨大豆营养肉汤

青霉素-链霉素溶液 厂家 上海试四赫维化工有限公司 Sigma Company Amersco Company 上海楷洋生物技术有限公司 Amersco Company 国药集团化学试剂有限公司 广东光华科技股份有限公司 广东光华科技股份有限公司 广东光华科技股份有限公司 天津大茂化学试剂厂 广东光华化学厂有限公司 天津大茂化学试剂厂 天津科密欧化学试剂厂 上海三爱思试剂有限公司 汕头市西陇化工厂有限公司 Amresco Company Sigma Company Amresco Company 广东光华化学厂有限公司 浙江天杭生物科技有限公司 HyClone Company HyClone Company 北京陆桥技术公司 北京陆桥技术公司 Beyotime Company 规格 AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR

广西师范学院硕士学位论文

2.2 六堡茶中各极性部分的抗氧化研究

取散装六堡茶一定量用手提式高速中药粉粹机全部粉碎，并用标准筛进行筛选备用。称取两千克粉碎后的六堡茶粉末，浸泡于95% 乙醇中数天。过滤浸提液并减压悬蒸滤液至干，得总浸膏56.2 g。用适量蒸馏水将浸膏溶解，适当进行超声，溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，将个萃取后的提取液减压浓缩至浸膏，称量得到石油醚相

9.3785 g，乙酸乙酯相17.9069 g，正丁醇相23.1440 g，水相4.5968 g。各萃取后极性部分分别取适量进行抗氧化、抗菌以及抗肿瘤活性测定。

2.2.1 原理和方法

2.2.1.1 DPPH自由基的清除

1,1-二苯基苦基苯肼 (1,1-dipHenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 是一种稳定的自由基，当溶解于有机溶剂如无水乙醇中时，溶液显紫色，并且在517 nm的波长下有较强的吸收，配制好的溶液需避光存放。DPPH是含氮原子并含有三个苯环的结构，结构式中氮原子上含有单一电子，可以接受一个单电子或者氢离子。当待测物质中含有单电子并与DPPH的氮原子上的单电子配对时，溶液颜色变浅，在波长517 nm下的吸收强度降低。溶液的颜色变化和待测物质的浓度存在一定的线性关系，因此我们选择通过不同浓度的待测物加入DPPH溶液后在517 nm波长下吸光度值的变化来测定物质的抗氧化活性[1-7]。

实验方法：

称取六堡茶提取液经萃取后的各极性部分浸膏和芦丁及Vc，分别用无水乙醇配制成浓度为1 mg/mL，测量时分别稀释至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL。准确称量DPPH 0.0197g，(M=394.32)，用无水乙醇溶解定容至250 mL容量瓶中，得到浓度为2×10-4 mol/L的DPPH溶液，备用，避光冷藏。按表2-3加入溶液进行测定

表2-3 DPPH 清除作用加样表

Table 2-3 Scavenging effect of sample tables

A0 2 mL DPPH + 2 mL 无水乙醇

As 2 mL DPPH + 2 mL 各极性部分浸膏（或对照样品）

Aj 2 mL 无水乙醇 + 2 mL 各极性部分浸膏（或对照样品）

按表2-3 中加入溶液后充分摇匀，黑暗处静置30 min，然后以无水乙醇为空白，在517nm 下测定溶液A0、Ai、Aj相对应的吸光度值，根据清除率公式计算其清除率值。

广西六堡茶化学成分分离、活性分析及茶褐素提取工艺研究

DPPH清除作用的清除率公式：

清除率=[1-(As-Aj)/A0] × 100%

若测定结果在不同浓度下的清除率基本接近时，稀释样品溶液或者增加DPPH的浓度。然后根据所测数据作图观察样品对DPPH的清除作用。

2.2.1.2 Fonton反应法测定羟基自由基的清除

原理：

依据文献方法并相应改变后，根据亚铁离子催化过氧化氢产生羟基自由基的Fonton反应原理，在pH值为2 ~ 9的条件下，邻二氮菲与亚铁离子发生络合反应，生成稳定的Fe(pHen)32+，反应过程中亚铁离子被氧化成三价铁离子，溶液的颜色发生改变，在特定波长处的吸光度值发生改变，通过对吸光度值的测定计算样品的清除率[8-13]。

H2O2 + Fe2+ → Fe3+ +·OH + OH -

方法：

(1) 确定最大吸收波长：

移液管量取0.8 mmol/L邻二氮菲溶液3 mL，PBS缓冲溶液4 mL，去离子水1 mL相继加入10 mL的具塞比色管中，摇匀，然后加入0.8 mmol/L的硫酸亚铁溶液1 mL，95%的乙醇1 mL，混匀后在37℃的水浴中温浴一小时，用去离子水作为空白对照，在紫外-可见分光光度计上190 nm - 800 nm进行波谱扫描，据扫描结果，确定最大吸收波长为510 nm。

(2) 样品测定：

移液管量取配置好的0.8 mmol/L的邻二氮菲溶液3 mL，PBS缓冲溶液4 mL，蒸馏水1 mL，相继加入10 mL的具塞比色管中，摇匀，加入0.8 mmol/L的硫酸亚铁溶液1mL，0.01%H2O2溶液1 mL，混匀后在37℃的水浴锅中温浴1 h，用蒸馏水做对照，在510 nm波长下测定吸光度，记为A0；取1 mL无水乙醇代替H2O2加入具塞比色管中，测定吸光度值，记为Ai；然后用移液管量取1 mg/mL的样品（对照Vc）溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞比色管中，依次加入0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL的去离子水，摇匀，，按Ao 、Ai的方法先后加入邻二氮菲溶液3 mL，PBS缓冲溶液4 mL，去离子水1 mL，摇匀后加入硫酸亚铁溶液1 mL，H2O2溶液1 mL，摇匀后于37℃的水浴锅中温热1 h，在510 nm波长处测定吸光度值，记为Aj。

清除率公式：

清除率=[(Aj-A0)/(Ai-A0)] ×100%

根据测定的吸光度值作图观察清除率作用。

  本文关键词：广西六堡茶化学成分分离、活性分析及茶褐素提取工艺研究，由笔耕文化传播整理发布。