β-葡萄糖苷酶基因的筛选及性质分析

发布时间：2017-10-10 11:37

  本文关键词：β-葡萄糖苷酶基因的筛选及性质分析

  更多相关文章： 宏基因组 秸秆 β-葡萄糖苷酶 酶学性质 真核表达

【摘要】：β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase,EC3.2.1.21),属于纤维素酶类,是三种纤维素分解酶中的重要组成成分之一,它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键,同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶有较广泛的工业应用,可用来降解纤维素生产生物乙醇、改善食品风味、转化大豆异黄酮糖苷化合物、制备低聚龙胆糖、防治病虫害等。但目前工业用β-葡萄糖苷酶多数来源于木霉等真菌,反应条件(如温度、pH)适应范围相对较窄,且酶活力偏低,造成经济成本较高,制约β-葡萄糖苷酶的广泛应用。为获得酶学特性优良且酶活力高的β-葡萄糖苷酶,本研究用黑龙江玉米秸秆土壤微生物群落成功构建了一个高质量的宏基因组文库,并利用功能筛选法从文库中筛选到一个新型β-葡萄糖苷酶基因bgl2238,该基因全长2238 bp,可编码745个氨基酸,通过氨基酸序列分析,预测Bgl2238蛋白分子大小为80.67 kDa,pI值为4.95,是一种结构较稳定、疏水性高且无信号肽序列的酸性蛋白质;经同源性分析,发现其与来源于Bacteroides thetaiotaomicron的β-葡萄糖苷酶(GenBank:WP_048691945.1)具有58%的相似性,属于GH3超家族和GH3C超家族酶。通过PCR技术扩增bgl2238基因,并成功构建重组表达载体pET-32a(+)-bgl2238,以E.coli BL21(DE3)为宿主菌株,对其进行高效表达。重组Bgl2238菌株表达条件的优化结果显示,Bgl2238最佳诱导温度和时间分别为25℃、11 h,IPTG最适诱导浓度为1.0 mM,此时表达量为10.42 U/ml。对重组酶Bgl2238的酶学性质进行研究,发现重组Bgl2238最适反应pH和温度分别为6.10,44℃,该酶最大比活达到29.1 U/mg,且在4~50℃范围内,热处理重组Bgl2238 4 h后仍保留75%以上的酶活力,热稳定性较好。以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物时其Vmax=576uM/min,Km=0.296 mM,以纤维二糖为底物时,其Vmax=572 uM/min,Km=0.543 mM。不同浓度的K+、Na+、Fe~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Ca~(2+)、Co~(2+)、Zn~(2+)和Ni~(2+)对酶活力均有较大促进作用,其中Fe~(2+)对Bgl2238酶活力的促进作用最大,10 mM Fe~(2+)使酶活力高达260%;低浓度1 mM的SDS、EDTA和咪唑对β-葡萄糖苷酶Bgl2238酶活力有较弱的抑制作用,在100 mM时,SDS、EDTA和咪唑对酶的抑制作用加强;尿素、盐酸胍和异硫氰酸胍在1 mM时对β-葡萄糖苷酶Bgl2238的酶活力均有促进作用,在高浓度时,Bgl2238酶活力仍分别保留97%、52%、48%。有机溶剂DMSO、甲醇、乙醇、异丙醇、Triton X-100在1 mM时对β-葡萄糖苷酶Bgl2238的酶活力均有促进作用,在高浓度时,对酶均有一定的抑制作用,但令人感兴趣的是,DMSO浓度高达100 mM时,Bgl2238的酶活力仍保留85%以上,此外Triton X-100浓度的升高反而促进重组Bgl2238的酶活力,说明重组Bgl2238对有机溶剂有较好的耐受性,在工业应用中具有很好的应用前景。葡萄糖作为β-葡萄糖苷酶酶促反应的产物,对酶促反应有一定的反馈抑制作用,但当葡萄糖浓度为1.0 M时,Bgl2238剩余酶活为56%左右,表明Bgl2238对葡萄糖有一定的耐受性。将bgl2238基因克隆到酵母表达载体上,并转入酿酒酵母菌株INVSC1中,得到可溶性高表达的重组蛋白,表达量达17.1 U/ml,比活力为38.7 U/mg。本论文成功构建高质量的黑龙江玉米秸秆土壤宏基因组文库,获得了一个新型的β-葡萄糖苷酶基因,将其在原核系统中表达后,对重组酶的酶学性质进行了研究,并探索了该基因在真核表达系统中的表达情况。本论文的研究结果不但拓宽了b-葡萄糖苷酶的种类和研究领域,对于丰富纤维素酶的来源、加强未培养微生物中纤维素酶的应用研究都具有一定的价值。
【关键词】：宏基因组 秸秆 β-葡萄糖苷酶 酶学性质 真核表达
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q55
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 前言13-24
• 1.1 纤维素酶研究概况13-16
• 1.1.1 纤维素的简介13-14
• 1.1.2 纤维素酶的简介14-16
• 1.2 β-葡萄糖苷酶简介16-19
• 1.2.1 β-葡萄糖苷酶的定义和分类16-17
• 1.2.2 β-葡萄糖苷酶的结构17
• 1.2.3 β-葡萄糖苷酶的理化性质17-18
• 1.2.4 β-葡萄糖苷酶的应用18-19
• 1.3 宏基因学简介19-21
• 1.3.1 宏基因组学概念19-20
• 1.3.2 宏基因组学的研究策略20
• 1.3.3 宏基因组技术的应用20-21
• 1.4 秸秆还田土壤的简介21-22
• 1.5 本研究的目的和意义22-23
• 1.6 本论文的主要研究内容23-24
• 第二章 玉米秸秆还田土壤宏基因组文库构建及新型β-葡萄糖苷酶基因的筛选24-42
• 引言24-25
• 2.1 实验材料25-28
• 2.1.1 实验样品来源25
• 2.1.2 菌种和质粒25
• 2.1.3 主要仪器和设备25-26
• 2.1.4 培养基26
• 2.1.5 工具酶、试剂盒和其他试剂26-27
• 2.1.6 相关溶液的配制27-28
• 2.2 实验方法28-33
• 2.2.1 玉米秸秆还田土壤基因组总DNA的提取及纯化28-29
• 2.2.2 玉米秸秆还田土壤宏基因组文库的构建29-32
• 2.2.3 宏基因组文库的评估32
• 2.2.4 土壤宏基因组文库β-葡萄糖苷酶的筛选32
• 2.2.5 测序及序列的生物信息学分析32-33
• 2.3 实验结果与分析33-41
• 2.3.1 玉米秸秆还田土壤总DNA的提取及纯化33
• 2.3.2 土壤总DNA的不完全酶切33-35
• 2.3.3 土壤宏基因组文库的评估35-36
• 2.3.4 土壤宏基因组文库中β-葡萄糖苷酶的筛选36
• 2.3.5 β-葡萄糖苷酶阳性克隆子的酶切验证36-37
• 2.3.6 测序及生物信息学分析37-39
• 2.3.7 Bgl2238的氨基酸序列、二级结构分析39-41
• 2.4 本章小结与讨论41-42
• 第三章 β-葡萄糖苷酶基因的原核表达、表达条件优化及其酶学性质研究42-72
• 引言42
• 3.1 实验材料42-46
• 3.1.1 各种试剂的配制42-45
• 3.1.2 菌种与质粒45
• 3.1.3 主要试剂45
• 3.1.4 培养基45
• 3.1.5 主要仪器设备45-46
• 3.2 实验方法46-55
• 3.2.1 β-葡萄糖苷酶基因bgl2238的引物设计及合成46
• 3.2.2 β-葡萄糖苷酶基因bgl2238的克隆46-47
• 3.2.3 PCR产物的纯化47
• 3.2.4 PCR产物和载体的双酶切、回收47
• 3.2.5 bgl2238与载体连接47-48
• 3.2.6 E .coli BL21(DE3)钙转感受态细胞的制备及转化48
• 3.2.7 重组克隆子的筛选及鉴定48-49
• 3.2.8 重组表达菌株表达条件的优化及纯化49-50
• 3.2.9 目的基因的诱导表达50
• 3.2.10 重组β-葡萄糖苷酶Bgl2238的纯化50-51
• 3.2.11 重组β-葡萄糖苷酶Bgl2238的SDS-PAGE凝胶检测51-52
• 3.2.12 标准曲线的制作52-53
• 3.2.13 重组β-葡萄糖苷酶Bgl2238的酶学性质研究53-55
• 3.3 实验结果和分析55-69
• 3.3.1 β-葡萄糖苷酶基因bgl2238的克隆55-56
• 3.3.2 重组表达载体的验证56-57
• 3.3.3 重组β-葡萄糖苷酶表达条件的优化57-60
• 3.3.4 重组蛋白Bgl2238的分离纯化60-61
• 3.3.5 β-葡萄糖苷酶酶学性质分析61-69
• 3.4 本章小结与讨论69-72
• 第四章 β-葡萄糖苷酶酿酒酵母真核表达72-82
• 引言72-73
• 4.1 实验材料73-75
• 4.1.1 菌株与质粒载体73
• 4.1.2 酶和生化试剂73
• 4.1.3 试剂盒73
• 4.1.4 培养基73-75
• 4.1.5 实验仪器75
• 4.2 实验方法75-77
• 4.2.1 β-葡萄糖苷酶基因的引物设计与合成75
• 4.2.2 基因的PCR扩增、酶切、载体连接和化转大肠杆菌DH5a75
• 4.2.3 重组子的筛选及鉴定75
• 4.2.4 酿酒酵母INVSC1电转感受态的制备及转化方法75-76
• 4.2.5 酵母重组子的鉴定76
• 4.2.6 重组蛋白Bgl2238的表达和纯化76-77
• 4.2.7 重组蛋白Bgl2238的SDS-PAGE凝胶检测77
• 4.3 实验结果和分析77-80
• 4.3.1 β-葡萄糖苷酶基因的鉴定77-78
• 4.3.2 酵母重组子pYES2-bgl2238的鉴定78-80
• 4.3.3 重组Bgl2238的诱导表达和分离纯化80
• 4.4 本章小结与讨论80-82
• 第五章 总结与展望82-84
• 5.1 结论82-83
• 5.2 展望83-84
• 参考文献84-91
• 缩略词91-92
• 附录 硕士研究生期间发表论文92-93
• 致谢93

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李远华;β-葡萄糖苷酶的研究进展(综述)[J];安徽农业大学学报;2002年04期

2 滕芳超;李多川;李亚玲;李浙江;;嗜热毛壳菌一种β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性[J];菌物学报;2006年03期

3 孙艳梅;张永忠;许晶;李文滨;;黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷研究[J];东北农业大学学报;2007年01期

4 祝长青;李艳红;周辉;曾献春;赵惠新;;黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的分离[J];华中师范大学学报(自然科学版);2007年01期

5 闫会平;陈士华;吴兴泉;;黑曲霉β-葡萄糖苷酶的研究进展[J];纤维素科学与技术;2007年01期

6 方尚玲;刘源才;张庆华;林英;陈道玉;李世杰;;细菌产β-葡萄糖苷酶发酵优化[J];化学与生物工程;2007年09期

7 潘利华;罗建平;查学强;王贵娟;李想;;海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的制备及其性质研究[J];合肥工业大学学报(自然科学版);2007年10期

8 赵林果;王平;倪浩;宗雅冬;余世袁;;补料发酵法制备β-葡萄糖苷酶的研究[J];工业微生物;2008年06期

9 朱凤妹;李军;杜彬;刘长江;;β-葡萄糖苷酶产生菌的选育及其性质研究[J];安徽农业科学;2008年03期

10 陈红漫;赵璐;;芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性研究[J];河北农业大学学报;2009年03期

中国重要会议论文全文数据库 前9条

1 孟宪文;宋小红;陈历俊;刘长江;;β-葡萄糖苷酶的研究进展[A];中国奶业协会年会论文集2009（下册）[C];2009年

2 刘小杰;何国庆;陈启和;倪辉;;黑曲霉β-葡萄糖苷酶发酵培养基的优化[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年

3 易松强;郑火青;张翠平;魏文挺;胡福良;;蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性测定及来源的研究[A];“蜂之巢”2010年全国蜂产品市场信息交流会暨中国（武汉）蜂业博览会论文集[C];2010年

4 张金连;张翠平;郑火青;易松强;胡福良;;基于β-葡萄糖苷酶活力蜂蜜真伪鉴别研究[A];2012年全国蜂产品市场信息交流会暨中国（江苏）蜂业博览会论文集[C];2012年

5 张金连;张翠平;郑火青;易松强;胡福良;;基于β-葡萄糖苷酶活力的蜂蜜真伪鉴别研究[A];第五届中国畜牧科技论坛论文集[C];2011年

6 蔡亚楠;郁彩虹;高裙裙;张琦;张耀东;;木犀草素和β-葡萄糖苷酶相互作用的荧光光谱法研究[A];中国化学会第十届全国发光分析学术研讨会论文集[C];2011年

7 李宁;陈磊;宗敏华;;一种来源于西梅籽的耐受葡萄糖的β-葡萄糖苷酶的分离纯化[A];2010年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨华南地区农产品加工产学研研讨会论文摘要集[C];2010年

8 余伟;王宏勋;张晓昱;;酶法转化槐角异黄酮的研究[A];“环境与健康”学术研讨会论文摘要集[C];2007年

9 刘颖;高晗;范婷婷;;海藻酸钠包埋交联法固定化β-葡萄糖苷酶的研究[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 周荧;β-葡萄糖苷酶的固定化及其在异黄酮生物转化中的应用[D];华中农业大学;2013年

2 夏伟;嗜热真菌第3家族β-葡萄糖苷酶的多样性和分子改造[D];浙江大学;2016年

3 赵林果;β-葡萄糖苷酶的制备与回收利用及其基因的克隆表达[D];南京林业大学;2007年

4 吴鹏;基因重组酒香酵母菌株高产β-葡萄糖苷酶的高密度液态发酵模型及酶学性质研究[D];华中农业大学;2012年

5 徐荣燕;嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年

6 王玉霞;阿氏丝孢酵母（Trichosporon asahii）β-葡萄糖苷酶及葡萄糖苷类风味物质水解机制的研究[D];江南大学;2012年

7 李倩;β-葡萄糖苷酶基因在调控果实成熟及内源ABA水平中的作用分析[D];中国农业大学;2015年

8 张益波;新型β-葡萄糖苷酶菌株syzx4筛选、发酵及酶纯化表征和应用[D];吉林大学;2011年

9 朱允华;黄翅大白蚁（Macrotermes barneyi）肠道微生物多样性分析及β-葡萄糖苷酶基因的克隆与鉴定[D];湖南农业大学;2012年

10 周庆新;木霉纤维素膨胀因子Swollenin与β-葡萄糖苷酶的功能研究[D];山东大学;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 高天龙;β-葡萄糖苷酶的理性改造[D];山东大学;2014年

2 杨娟;鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶的提取、活性分析及性质研究[D];福建农林大学;2013年

3 胡丹;橡胶籽中β-葡萄糖苷酶的热稳定性研究[D];海南大学;2016年

4 夏玉林;β-葡萄糖苷酶基因的筛选及性质分析[D];广东药科大学;2016年

5 沙莎;β-葡萄糖苷酶的生产菌株选育、固定化及分离纯化的研究[D];华中农业大学;2013年

6 华骏;β-葡萄糖苷酶高产菌株选育及其酶学性质研究[D];安徽工程大学;2016年

7 高院妮;β-葡葡糖苷酶基因的克隆及表达研究[D];云南大学;2016年

8 任建伟;β-葡萄糖苷酶高产菌株选育及发酵条件优化[D];浙江大学;2016年

9 袁晓华;β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选、培养条件优化及β-葡萄糖苷酶应用研究[D];山东大学;2009年

10 陈军杰;β-葡萄糖苷酶的液态发酵生产及其应用[D];江南大学;2005年

，

本文编号：1006150