miRNA-625结合位点多态性对靶基因AKT2调控的影响

发布时间：2017-10-10 23:08

  本文关键词：miRNA-625结合位点多态性对靶基因AKT2调控的影响

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【摘要】：目的本实验构建AKT2基因3’端非翻译区(3’untranslated regions,3’-UTR)荧光素酶报告基因重组质粒,在培养的体外细胞中验证miRNA-625与AKT2基因的靶向调控关系,同时构建miRNA-625靶序列中的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)rs2304186突变型荧光素酶报告基因重组质粒,验证SNP rs2304186在miRNA-625靶序列调控中的作用。方法通过生物信息学软件TargetSan预测AKT2是miRNA-625的靶基因。PCR扩增AKT2基因3’-UTR,构建AKT2 3’-UTR rs2304186野生型荧光素酶报告基因载体(pMIR-AKT2-WT)、miRNA-625靶位点全突变型质粒(pMIR-AKT2-MUT1)及rs2304186突变型质粒(pMIR-AKT2-MUT2),通过Lipofectamine 2000将重组质粒与miRNA-625 mimics或miRNA NC共转染16HBE细胞株、HEK-293T细胞株及A549细胞株,每个转染组同时加入pRL-SV40作为矫正,双荧光素酶报告基因检测系统检测萤火虫(Firefly)荧光素酶和海肾(Renilla)荧光素酶活性。结果构建的重组荧光素酶报告载体经PCR、双酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测系统结果显示在三种细胞株中pMIR-AKT2-WT+miRNA-625mimics组相对荧光素酶活性比pMIR-AKT2-MUT2+miRNA-625 mimics均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05),pMIR-AKT2-MUT2+miRNA-625 mimics比pMIR-AKT2-MUT1+miRNA-625 mimics组明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论miRNA-625对野生型AKT2 3’-UTR荧光素酶报告基因载体荧光素酶活性有明显的抑制作用,证实miR-625能够靶向调控AKT2基因。同时位于miRNA-625靶序列中的SNP rs2304186 TT型能够降低miRNA-625与靶序列的结合效率。
【关键词】：miRNA-625 AKT2基因 荧光素酶报告基因 3’端非翻译区 单核苷酸多态性
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R562.25
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-8
• 英文缩略词8-11
• 第一章 绪论11-16
• 1、支气管哮喘介绍11
• 2、miRNA介绍11-12
• 3、SNP的介绍12-13
• 4、AKT蛋白13-14
• 5、结论14-15
• 6、实验流程15-16
• 第二章 材料与方法16-29
• 2.1 材料：16-19
• 2.1.1 主要试剂16-17
• 2.1.2 主要设备 ：17-18
• 2.1.3 主要配置的试剂18-19
• 2.2 方法19-29
• 2.2.1 人体DNA抽提 参照TAKARA全血DNA抽提试剂盒说明书19-20
• 2.2.2 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后纯化回收20-21
• 2.2.3 将纯化回收的PCR产物经SacⅠ和HindⅢ 双酶切酶切反应21
• 2.2.4 pMIR-Report质粒与pRL-SV40转化、扩增及冻存21
• 2.2.5 质粒抽提21-22
• 2.2.6 将提取的pMIR-Report质粒进行SacⅠ和HindⅢ 双酶切22-23
• 2.2.7 pMIR-AKT2重组载体构建23
• 2.2.8 将克隆成功的pMIR-AKT2重组载体PCR、双酶切及测序鉴定23-24
• 2.2.9 定点突变24-26
• 2.2.10 细胞复苏、换液、传代及冻存26-27
• 2.2.11 16HBE、HEK-293T细胞株及A549细胞株转染27-28
• 2.2.12 双荧光素酶活性检测28
• 2.2.13 统计学分析28-29
• 第三章 结果29-37
• 3.1 miRNA-625与AKT2基因互补配对序列的预测29
• 3.2 AKT23’-UTR野生型与突变型质粒鉴定29-34
• 3.3 转染后荧光素酶活性检测34-37
• 第四章 讨论37-40
• 第五章 结论与展望40-41
• 第六章 参考文献41-46
• 第七章 综述46-68
• 1.miRNA概述47-49
• 2.miRNA在支气管哮喘中的研究49-58
• 3.结论58
• 4.参考文献58-68
• 攻读硕士期间发表的论文68-69
• 致谢69

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3 房师松,邓平建,赵树进;基因沉默机制与预防对策[J];卫生研究;2004年04期

4 陈雪梅,杜显刚,谭志巍,王亚琴,官鹏;基因沉默的研究进展[J];法律与医学杂志;2005年03期

5 字友梅;王少元;;新基因功能的研究策略[J];医学综述;2011年10期

6 汤富酬,李成建,薛友纺;双链RNA在基因沉默中的作用[J];中国生物化学与分子生物学报;2002年06期

7 卞晓翠;刘玉琴;;基因功能的抑制[J];中华病理学杂志;2006年05期

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10 ;小资料[J];环境与职业医学;2005年06期

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1 袁诚;李萃;马金;韩成贵;于嘉林;Andrew Jackson;李大伟;;大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默载体系统的改造及其应用[A];中国植物病理学会2009年学术年会论文集[C];2009年

2 陈翔;;RNAi:从科学家的剪九到医师的治疗手段[A];中华医学会第十二次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2006年

3 施定基;张文俊;邓元告;冉亮;康瑞娟;赵兴贵;张越南;;藻类基因工程的一些进展[A];中国海洋生化学术会议论文荟萃集[C];2005年

4 王海光;李自超;;植物干旱胁迫应答基因及其产物研究进展[A];2003年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2003年

5 陈爱葵;李梅红;;RNAi—基因沉默[A];遗传学进步与人口健康高峰论坛论文集[C];2007年

6 项晓琼;;RNAi技术在毒理学中的应用[A];中国药理学会毒理专业委员会第十次学术会议论文摘要汇编[C];2004年

7 刘家云;郝晓柯;李庆霞;马龙洋;温伟红;贾林涛;杨安钢;;靶向X区的siRNA抑制HBV基因的表达和复制[A];第九届西北五省（区）检验医学学术会议论文汇编[C];2005年

8 焦锋;楼程富;;基因在植物多倍体中的进化研究进展[A];中国蚕学会第三届青年学术研讨会暨浙江省第二届青年学术论坛——蚕桑分论坛论文集（上册）[C];2001年

9 吴丽娟;陈伟;康格非;蒋建新;朱佩芳;;锌指蛋白A20基因沉默载体研究与初步应用[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年

10 徐新云;毛侃琅;毛吉炎;;CYP3A4基因沉默和高表达对三氯乙烯致肝细胞毒性的影响[A];中国毒理学会第六届全国毒理学大会论文摘要[C];2013年

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1 Esha Dey Pallavi Ail 编译 硕军;“基因沉默”先导者[N];医药经济报;2013年

2 南方日报记者 张胜波　林亚茗 通讯员 粤科宣;“广东是成果产业化好地方”[N];南方日报;2011年

3 记者 李荔;朱冰：环境也可以改变基因[N];北京科技报;2012年

4 记者 毛黎;科学家成功解开大量基因沉默之谜[N];科技日报;2008年

5 医学博士 科学松鼠会成员 致桦;美丽的干扰[N];中国经营报;2010年

6 纪光伟;2006,最出彩的是基因[N];健康报;2006年

7 张田勘;基因编辑器被寄予厚望[N];中国医药报;2014年

8 张田勘;垃圾DNA并非垃圾[N];文汇报;2012年

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本文编号：1009111