Ⅱ类启动子调控CRISPR系统中sgRNA的表达实现特异性的基因突变

发布时间：2017-10-11 02:27

  本文关键词：Ⅱ类启动子调控CRISPR系统中sgRNA的表达实现特异性的基因突变

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【摘要】：CRISPR/Cas9系统,作为新兴的强有力的基因编辑以及遗传筛选工具,通过体外基因编辑,在疾病模型的建立以及基因治疗等生物医学领域方面具有广泛的的应用前景。然而,CRISPR/Cas9系统在实际应用过程中仍然面临着一些技术难题,问题之一就在于很难进行精准可控的基因编辑。CRISPR/Cas9系统在行使基因编辑功能的过程中主要包括两个成员,Cas9蛋白和单链的引导RNA(sigle-guide RNA,sgRNA)。其中Cas9蛋白是由RNA聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ)类启动子调控表达的一种核酸酶,可以进行组织细胞的特异性表达调控。sgRNA用于识别靶位点,其转录是受到RNA聚合酶Ⅲ(pol Ⅲ)类启动子调控的。而Ⅲ类启动子调控表达的一大缺陷就在于难以控制,受其调控的基因一般会呈现出类似于看家基因的“无处不在”表达的特点,因此使sgRNA也能以一种组织特异性表达调控的方式进行表达更有利于组织特异性基因突变的产生。本文中,我们对经典的CRISPR/Cas9系统进行巧妙的修改,使sgRNA也能在RNA聚合酶Ⅱ类启动子的调控下进行表达,并进一步通过使用细胞特异性启动子来调控sgRNA的表达从而实现了细胞特异性的基因突变。为了能获得RNA聚合酶Ⅱ类启动子调控的sgRNA,我们构建获得microRNA-shRNA与sgRNA镶嵌(mi Rsh-sgRNA)盒。该结构中的sgRNA是受RNA聚合酶Ⅱ类启动子调控的,并能够从红色荧光蛋白的3,非翻译区(untranslational region,UTR)转录出来,为了检测功能性的sgRNA能否在此结构中顺利产生,我们将广谱性启动子EF1a调控的miRsh-sgp53表达载体以及Cas9-P2A-EGFP表达载体共同转染小鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)和小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)。转然后两基因一般会呈现出类似于看家基因的“无处不在”表达的特点,因此使sgRNA也能以一种组织天采用流式细胞分选(flurorescence-activated cell sorting,FACS)的方式分选出双荧光蛋白表达的细胞,并对分选出的细胞进一步进行T7EN1酶切及sanger测序,结果表明无论是MEFs还是mESCs,EF1a启动子调控mi Rsh-sgp53产生的sg RNA都能够引导Cas9蛋白对p53基因进行双链切割(double strand breaks,DSB)。为了进一步证实是否mi Rsh-sg RNA盒能够以细胞类型特异性的方式产生基因突变,我们构建获得小鼠胚胎类启动子调控的。而Ⅲ类启动子调控表达的一大缺陷就在于难以控制,受其调控的基因一般会呈现出类干细胞特异性的Oct4启动子(mouse Oct4 gene promoter,mOct4P)来调控sgRNA表达的mi Rsh-sgp53盒,将该载体以及EF1a启动子调控表达的Cas9-P2A-EGFP表达载体共同转染MEFs和mESCs两天后,在mESCs中,我们能够观察到红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白共同表达的细胞,但在MEFs中,仅有绿色荧光蛋白的表达,这一现象表明sgRNA以细胞类型特异性的方式产生。通过流式细胞分选的方式分选出这两类细胞进一步进行T7EN1酶切及sanger测序分析。我们发现p53基因的突变仅发生在小鼠胚胎干细胞中,而没有发生在小鼠成纤维细胞中。此外,T7EN1酶切及sanger测序表明我们构建的这种由RNA聚合酶Ⅱ类启动子调控CRISPR/Cas9系统较经典的CRISPR/Cas9系统在所有被检测的细胞中,均没有带来额外的脱靶效应。
【关键词】：CRISPR/Cas9系统 单链引导RNA RNA聚合酶Ⅱ类启
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-24
• 1.1 CRISPR/Cas9系统12-18
• 1.1.1 CRISPR/Cas系统的发现12
• 1.1.2 CRISPR/Cas系统的结构12-13
• 1.1.3 CRISPR/Cas系统的作用机理13-15
• 1.1.4 CRISPR/Cas系统的分类15
• 1.1.5 CRISPR/Cas9基因编辑技术研究进展15-16
• 1.1.6 CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用16-18
• 1.1.7 CRISPR/Cas9系统的诱导性调控18
• 1.2 miRNA-shRNA嵌套结构18-21
• 1.2.1 RNA干扰技术18-20
• 1.2.2 miRNA-shRNA嵌套结构的出现20-21
• 1.3 P53基因概述21-22
• 1.4 本研究的目的及意义22-24
• 2 材料与方法24-45
• 2.1 实验材料24-30
• 2.1.1 质粒24
• 2.1.2 工具酶、试剂盒及其它试剂24-26
• 2.1.3 引物序列26-27
• 2.1.4 主要器材27-28
• 2.1.5 缓冲液及主要试剂的配制28-30
• 2.1.6 主要生物学分析软件30
• 2.2 实验方法30-45
• 2.2.1 载体骨架的构建30-35
• 2.2.2 miRsh-sgp53的构建35-37
• 2.2.3 RNA聚合酶Ⅱ类启动子调控的miRsh-sgp53载体的构建37-41
• 2.2.4 细胞培养及转染41-43
• 2.2.5 流式细胞仪分选阳性细胞43
• 2.2.6 T7EN1酶切实验43-44
• 2.2.7 sanger测序44-45
• 3 结果与分析45-51
• 3.1 RNA聚合聚合酶Ⅱ类启动子调控的miRsh-sgp53载体的构建45-47
• 3.2 EF1a调控miRsh-sgp53盒内的sgRNA的表达情况47
• 3.3 干细胞特异性启动子调控miRsh-sgRNA盒内的sgRNA的表达情况47-48
• 3.4 miRsh-sgRNA盒差生脱靶效应情况48-51
• 4 讨论51-52
• 5 结论52-53
• 致谢53-54
• 参考文献54-59
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文59

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本文编号：1009996