rAAV2介导bFGF基因修饰间充质干细胞对小鼠骨骼肌钝挫伤修复的研究

发布时间：2017-10-11 04:43

  本文关键词：rAAV2介导bFGF基因修饰间充质干细胞对小鼠骨骼肌钝挫伤修复的研究

  更多相关文章： 重组2型腺相关病毒(rAAV2) 碱性成纤维生长因子(bFGF) 间充质干细胞(MSCs) 骨骼肌顿挫伤

【摘要】：研究目的:本实验对小鼠骨骼肌钝挫伤造模后,应用重组腺相关病毒介导的碱性成纤维生长因子(bFGF)、间充质干细胞(MSCs)以及基因修饰的间充质干细胞分别对急性骨骼肌钝挫伤小鼠进行治疗,从组织学、生物化学等方面观察骨骼肌损伤修复过程中损伤组织bFGF、胶原蛋白I、IIImRNA表达以及血清肌酸激酶的变化,比较不同治疗方法的修复效果,丰富相应研究资料。研究方法:研究对象为100只清洁级雄性ICR小鼠,其中20只小鼠不造模作为正常对照组(A组),对其余的小鼠进行骨骼肌钝挫伤造模后随机分为4组:自然愈合组(B组)、细胞组(C组)、基因组(D组)、转基因细胞组(E组)。各组再分别设3天组、7天组、14天、21天组(每组5只)。参照罗丽等的方法建立骨骼肌钝挫伤模型,给小鼠腹腔注射5%水合氯醛将其麻醉,用脱毛膏将小鼠右后腿的毛清理干净,用自制的重物打击器,将小鼠后肢置于打击器底板上,使后肢处于伸膝,踝背屈90。位置,腓肠肌正对PVC管底端中心部位(管径大于砝码直径),手持20g砝码使其从81cm高的PVC管顶端顺着管内自由垂直落下打击小鼠腓肠肌,重力为0.157N,动能为0.157J,造模后保持皮肤完整,避免感染。正常对照组不做处理,其余组分别于损伤后即刻利用微量注射器和微电极推进器,向腓肠肌斜行进针,深度约3mm,分别注射注射40ul PBS、40ul MSCs(数量约为1x105)、40ul rAAV2-bFGF、40ul转染rAAV2-bFGF的MSCs(数量约为1x105),注射时间不少于3min,留针2min,分笼饲养。跟踪测试各组不同时间点下列指标:骨骼肌组织形态学变化、损伤组织bFGF、胶原蛋白I、IIImRNA表达以及血清肌酸激酶的变化。研究结果:(1)HE染色光镜和血浆CK活性变化提示,间充质干细胞以及碱性成纤维生长能促进大鼠急性腓肠肌钝挫伤后肌肉再生,减少瘢痕形成,加速损伤肌肉愈合的进程,,提高肌肉愈合质量。(2)伤后各组bFGF表达都显著高于A组(P0.05);随修复时间的增加,各组bFGF呈下降趋势,到第21天时E组bFGF表达仍显著高于正常对照组,各组bFGF量由高到低为E组、C组、D组、B组、A组。(3)伤后各组胶原蛋白ImRNA表达呈上升趋势,各组骨骼肌损伤后,各组I型胶原mRNA表达小幅上升,损伤后第7天,继续上升,第14天开始,I型胶原mRNA表达迅速上升,在21天时达到峰值,E组胶原蛋白ImRNA表达量最低。与A组相比,除第3天外,各组均有非常显著性差异(P0.01)。(4)各组胶原蛋白III mRNA表达量呈现先上升后下降的趋势,在第7天达到峰值,各组胶原蛋白III mRNA表达量由高到低依次是B组、D组、C组、E组、A组,说明间充质细胞及碱性成纤维生长因子抑制骨骼肌钝挫伤小鼠损伤局部组织I、III型胶原mRNA的表达。研究结论:(1)成功包装重组腺相关病毒rAAV2-bFGF,转染间充质干细胞后可表达报告基因,目的基因bFGF也高效表达。(2)rAAV2-bFGF基因治疗和间充质干细胞治疗可加快损伤肌肉愈合的组织学进程,抑制血清CK上升以及胶原蛋白Ⅰ、ⅢmRNA的表达,提高愈合质量。(3)随着时间的变化,各组治疗效果总趋势相同。(4)r AAV2-bFGF基因治疗和间充质干细胞治疗可促进损伤肌肉的bFGF表达,促进肌肉再生,两者联合效果更好。
【关键词】：重组2型腺相关病毒(rAAV2) 碱性成纤维生长因子(bFGF) 间充质干细胞(MSCs) 骨骼肌顿挫伤
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R685
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstracts6-10
• 序言10-12
• 1 文献综述12-23
• 1.1 肌肉损伤研究进展12-16
• 1.1.1 骨骼肌损伤的种类12
• 1.1.2 骨骼肌修复的机制12-14
• 1.1.3 骨骼肌损伤研究中的动物模型14-15
• 1.1.4 骨骼肌损伤的治疗15-16
• 1.2 碱性成纤维生长因子研究进展16-19
• 1.2.1.bFGF的结构17
• 1.2.2.bFGF的作用机制17
• 1.2.3 bFGF的生物学功能17-18
• 1.2.4 bFGF与MSCs的生物学作用18-19
• 1.3 腺相关病毒（AAV）19-20
• 1.3.1 腺相关病毒结构19-20
• 1.3.2 AAV作为基因载体的优缺点20
• 1.3.3 AAV在肌肉损伤方面的应用20
• 1.4 间充质干细胞（MSCs）研究进展20-23
• 1.4.1 间充质干细胞的来源及其优缺点21
• 1.4.2 间充质干细胞在组织修复方面的作用21-22
• 1.4.3 间充质干细胞的迁移及归巢能力22-23
• 2 材料和方法23-38
• 2.1 实验动物与分组23
• 2.2 小鼠肌肉损伤模型的制备23
• 2.3 rAAV2-bFGF的包装及鉴定23-33
• 2.3.1 pAAV-iRFP713-IRES-bFGF质粒的构建24-29
• 2.3.2 病毒包装、纯化及鉴定29-33
• 2.4 病毒感染MSCs33
• 2.5 注射33
• 2.6 取材33
• 2.7 检测指标与测试方法33-36
• 2.7.1 光镜观察腓肠肌HE染色33-34
• 2.7.2 bFGF表达的检测34-35
• 2.7.3 血浆CK活性测定35
• 2.7.4 腓肠肌胶原蛋白Ⅰ、ⅢmRNA表达量的测定35-36
• 2.8 实验所需主要仪器及试剂36
• 2.9 数据处理36-38
• 3 结果38-51
• 3.1 rAAV2--bFGF病毒包装结果及其在细胞内报告基因表达38-42
• 3.1.1 重组质粒pAAV-iRFP713-IRES-bFGF的鉴定38
• 3.1.2 rAAV2-bFGF病毒滴度测定结果38-39
• 3.1.3 病毒纯化结果的鉴定39-40
• 3.1.4 病毒感染MSCs的鉴定40-42
• 3.2 各组小鼠肌肉组织HE染色光镜观察结果比较42-46
• 3.3 各组小鼠肌肉bFGF蛋白表达的免疫组化结果46-47
• 3.4 各组小鼠血清肌酸激酶活性比较47-49
• 3.5 各组小鼠腓肠肌胶原蛋白III mRNA表达结果比较49-50
• 3.6 各组小鼠腓肠肌胶原蛋白I mRNA表达结果比较50-51
• 4 讨论51-56
• 4.1 不同治疗方法对骨骼肌急性钝挫伤小鼠组织形态学的影响51-52
• 4.2 不同治疗方法对骨骼肌急性钝挫伤小鼠bFGF蛋白表达量的影响52-53
• 4.3 不同治疗方法对骨骼肌急性钝挫伤小鼠血清肌酸激酶的影响53-54
• 4.4 不同治疗方法对骨骼肌急性钝挫伤小鼠胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ mRNA的影响54-56
• 5 结论56-57
• 6 参考文献57-65
• 7 攻读硕士学位期间公开发表论文65-66
• 8 致谢66-67

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