草鱼RLRs家族基因的甲基化状态与草鱼出血病的关联研究

发布时间：2017-10-11 05:07

  本文关键词：草鱼RLRs家族基因的甲基化状态与草鱼出血病的关联研究

  更多相关文章： 草鱼出血病 CiLGP2 Ci MDA5 CiRIG-I DNA甲基化

【摘要】：草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要的淡水经济鱼类,但各种细菌、病毒性疾病的暴发严重制约着草鱼养殖业的发展,其中危害最为严重的就是由草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引发的草鱼出血病。鱼类的抗病毒防御主要依赖先天性免疫系统,而模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR)对入侵病原微生物的识别构成了先天性免疫的第一道防线。RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)是一类胞内PRRs,包括LGP2(Laboratory of Genetics and Physiology 2)、黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma Differentiation Associated gene 5,MDA5)和维甲酸诱导基因I(Retinoic acid Induced Gene-I,RIG-I),能够识别入侵的病毒核酸并将信号传递至下游接头分子,最终诱导I型干扰素(Interferon,IFN-I)和促炎症因子的表达。已有研究证实,GCRV刺激后草鱼LGP2、MDA5和RIG-I基因(CiLGP2、CiMDA5、CiRIG-I)的表达量均显著上调,表明草鱼RLRs家族参与了GCRV抗病毒免疫反应,然而其表达调控机制尚不明确。本研究通过GCRV刺激后对草鱼RLRs家族基因的甲基化和表达量进行关联研究,并对易感/抗性个体间的甲基化状态进行差异分析,得到的主要结果如下:1.CiLGP2基因-1411 CpG位点具有多种甲基化模式,其在脾脏组织中的甲基化水平显著低于肌肉组织,且对应个体在脾脏组织中的基因表达量高于肌肉组织;2.CiLGP2基因CpG位点的甲基化水平在易感/抗性个体组间没有显著差异;3.CiMDA5基因+200、+202、+204和+207 CpA/CpG位点在易感个体组中的甲基化水平显著高于抗性个体组;4.CiMDA5基因在易感个体组中的表达量显著低于抗性个体组;5.CiRIG-I基因-534 CpG位点在易感个体组中的甲基化水平显著高于抗体个体组;6.CiRIG-I基因在易感个体组中的表达量显著低于抗性个体组;7.CiLGP2和Ci RIG-I基因5’侧翼区的CpG位点均有自发脱氨基现象发生。本研究的结论为:RLRs家族基因的抗病毒表达均受DNA甲基化负调控,CiMDA5密集甲基化元件(DME)和Ci RIG-I-534 CpG位点的甲基化与草鱼出血病抗性显著相关。本研究从表观遗传学水平揭示了草鱼RLRs家族基因抗病毒表达的调控机制,找寻到了与草鱼出血病抗性相关的甲基化位点,可以作为草鱼出血病的分子标记,并为草鱼抗病育种提供新思路。
【关键词】：草鱼出血病 CiLGP2 Ci MDA5 CiRIG-I DNA甲基化
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S943
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文献综述12-20
• 1.1 草鱼出血病概述12-14
• 1.1.1 草鱼呼肠孤病毒12-13
• 1.1.2 草鱼出血病的防治策略13-14
• 1.2 先天性免疫模式识别受体14-18
• 1.2.1 鱼类先天性免疫14
• 1.2.2 模式识别受体14-18
• 1.3 DNA甲基化18-19
• 1.3.1 表观遗传学18
• 1.3.2 DNA甲基化的调控机制18-19
• 1.3.3 DNA甲基化在鱼类的研究进展19
• 1.4 研究目的与意义19-20
• 第二章 草鱼LGP2基因的甲基化状态与草鱼出血病的关联分析20-31
• 2.1 前言20
• 2.2 材料与方法20-23
• 2.2.1 试验材料20-21
• 2.2.2 试验试剂和仪器21
• 2.2.3 攻毒试验21
• 2.2.4 基因组DNA的提取和亚硫酸氢盐修饰21
• 2.2.5 CiLGP2基因CpG岛预测21-22
• 2.2.6 BSP扩增22-23
• 2.2.7 总RNA提取与cDNA合成23
• 2.2.8 实时荧光定量PCR检测基因表达23
• 2.2.9 数据统计23
• 2.3 结果与分析23-29
• 2.3.1 易感与抗性个体鉴定23-24
• 2.3.2 CiLGP2基因CpG岛预测结果24-25
• 2.3.3 CpG位点甲基化状态以及与易感/抗性性状的关联分析25-27
• 2.3.4 -1411 CpG位点的甲基化状态与CiLGP2表达量的关联分析27-28
• 2.3.5 -1411 CpG位点转录因子预测28-29
• 2.4 讨论29
• 2.5 小结29-31
• 第三章 草鱼MDA5基因的甲基化状态与草鱼出血病的关联分析31-40
• 3.1 前言31
• 3.2 材料与方法31-33
• 3.2.1 试验材料31
• 3.2.2 试验试剂和仪器31
• 3.2.3 攻毒试验31
• 3.2.4 基因组DNA的提取和亚硫酸氢盐修饰31
• 3.2.5 CiMDA5基因CpG岛预测31
• 3.2.6 BSP扩增31-32
• 3.2.7 总RNA提取、cDNA合成与病毒检测32
• 3.2.8 实时荧光定量PCR检测基因表达32
• 3.2.9 数据统计32
• 3.2.10 生物信息分析32-33
• 3.3 结果与分析33-38
• 3.3.1 易感与抗性个体鉴定33
• 3.3.2 CiMDA5基因CpG岛预测结果33-34
• 3.3.3 CiMDA5中与抗性相关的甲基化位点34-36
• 3.3.4 CpA/CpG位点甲基化水平与基因表达的关联分析36
• 3.3.5 DME转录因子和蛋白结构域预测36-38
• 3.4 讨论38-39
• 3.5 小结39-40
• 第四章 草鱼RIG-I基因的甲基化状态与草鱼出血病的关联分析40-48
• 4.1 前言40
• 4.2 材料与方法40-42
• 4.2.1 试验材料40
• 4.2.2 试验试剂和仪器40
• 4.2.3 攻毒试验40
• 4.2.4 基因组DNA的提取和亚硫酸氢盐修饰40
• 4.2.5 CiRIG-I基因CpG岛预测40
• 4.2.6 BSP扩增40-41
• 4.2.7 总RNA提取、cDNA合成与病毒检测41
• 4.2.8 实时荧光定量PCR检测基因表达41
• 4.2.9 数据统计41-42
• 4.3 结果与分析42-46
• 4.3.1 易感与抗性个体鉴定42
• 4.3.2 CiRIG-I基因CpG岛预测结果42
• 4.3.3 CiRIG-I基因中与抗性相关的甲基化位点42-45
• 4.3.4 CiRIG-I基因表达与甲基化的关联分析45
• 4.3.5 -534与-293 CpG位点转录因子预测45-46
• 4.4 讨论46-47
• 4.5 小结47-48
• 结论48-49
• 参考文献49-55
• 附录55-59
• 缩略词59-61
• 致谢61-62
• 作者简介62

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