玫烟色棒束孢致病相关基因的差异表达研究

发布时间：2017-10-13 10:11

  本文关键词：玫烟色棒束孢致病相关基因的差异表达研究

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【摘要】：玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)是国内外生物防治中应用广泛的昆虫病原真菌之一,在小菜蛾的防治中发挥着重要的作用。本实验室筛选到一株对小菜蛾具有高致病力的玫烟色棒束孢菌株IFCF01。为了能够更深入了解玫烟色棒束孢对小菜蛾的致病机理、充分发挥该菌株的应用潜力,本研究采用荧光定量PCR技术对玫烟色棒束孢侵染小菜蛾过程中的8个潜在致病基因的表达情况进行了检测,推断不同基因在侵染过程中的作用。主要结果分述如下:在玫烟色棒束孢侵染致病小菜蛾的前期,与致病相关的基因为:第三类几丁质酶基因(ChiAⅢ)、L-丝氨酸脱水酶基因(L-Ser)、类脂滴蛋白酶基因(MPL-1)。结果表明:(1)ChiAⅢ基因在菌侵染小菜蛾后的第12 h、30 h、36 h的基因表达量显著高于对照中的表达量,在菌侵染小菜蛾后的第5 d、10 d基因的表达量显著的低于对照。(2)L-Ser基因在菌侵染小菜蛾后的第12 h的基因表达量显著高于对照和其他时间点的表达量。(3)MPL-1基因在菌侵染小菜蛾后的第12 h的基因表达量显著高于对照和其他时间点的表达量,除侵染后第12 h外,该基因在其他的处理时间点均呈现下调表达。在玫烟色棒束孢侵染致病小菜蛾的后期,与致病相关的基因有:cAMP依赖性蛋白激酶调节亚基基因(PK)、类马铃薯糖蛋白磷脂酶基因(PLP)、腺苷酸环化酶基因(ADC)、MAP激酶激活因子基因(MAPKK)、Mmc蛋白基因(Mmc)。结果表明:(1)Mmc基因在菌侵染小菜蛾的过程中,除侵染后第15 d,其余的各个时间点的基因表达量与对照相比均呈现为上调表达,其中,第24 h、30 h、36 h、10 d的表达量显著高于对照和其他时间点的表达量。(2)ADC基因在菌侵染小菜蛾后第12 h、24 h、30 h和36 h该基因呈现出下调表达,表达量均低于对照;该基因在菌侵染小菜蛾后第5 d、10 d、15 d呈现出上调表达,且基因表达量显著高于对照。(3)PLP基因在玫烟色棒束孢侵染小菜蛾后首先呈现出与对照表达量相似的稳定表达,直到侵染后第10 d和第15 d开始呈现出上调表达,该基因表达量在以上两个时间点均显著高于对照。(4)PK基因在玫烟色棒束孢侵染小菜蛾后第12 h、24 h、30 h和36 h呈现出下调表达,表达量均低于对照;在菌侵染小菜蛾后第5 d、10 d、15 d该基因呈现出上调表达且基因表达量均显著高于对照。(5)MAPKK基因在玫烟色棒束孢侵染小菜蛾的过程中始终是下调表达的,其中,除菌侵染小菜蛾后第15 d以外,其余时间点的基因表达量均显著低于对照。综上所述,本研究所选的8个玫烟色棒束孢潜在致病相关基因在真菌侵染致病小菜蛾过程中,除MAPKK基因表达量在整个侵染过程中的各个阶段相对于对照均下调表达外,其余7个基因的表达量均在真菌侵染致病的不同阶段有着显著的上调表达。其中,ChiAⅢ基因、L-Ser基因和MPL-1基因的表达量均在真菌侵染小菜蛾后第12 h显著高于对照,表明这三个基因参与并作用于玫烟色棒束孢对小菜蛾侵染致病前期的体壁入侵阶段;PK基因、PLP基因、ADC基因和Mmc基因的表达量在玫烟色棒束孢侵染致病小菜蛾后期(5 d、10 d、15 d)相对于对照显著高表达,表明这四个基因参与并作用于玫烟色棒束孢对小菜蛾的侵染致病后期的体内定殖及致死阶段。
【关键词】：玫烟色棒束孢 小菜蛾 致病相关基因 荧光定量检测
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476.12
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 缩略词8-12
• 1 前言12-19
• 1.1 概述12-13
• 1.2 昆虫病原真菌致病机制研究概况13-14
• 1.3 玫烟色棒束孢致病机制研究进展14-16
• 1.3.1 玫烟色棒束孢的入侵机制研究14-15
• 1.3.2 玫烟色棒束孢致病的分子机制研究15-16
• 1.4 论文研究思路16-18
• 1.4.1 研究的目的和意义16-17
• 1.4.2 研究的主要内容17-18
• 1.5 技术路线18-19
• 2 供试虫源及菌株荧光定量检测模板的获取19-28
• 2.1 材料与方法19-24
• 2.1.1 供试虫源及菌株19-20
• 2.1.2 主要实验仪器20-21
• 2.1.3 主要试剂、耗材21
• 2.1.4 主要培养基21-22
• 2.1.5 主要试剂的配制22
• 2.1.6 RNA的提取及cDNA的合成22-23
• 2.1.7 RNA完整性及浓度检测23
• 2.1.8 cDNA第一链合成23-24
• 2.2 结果与分析24-27
• 2.2.1 试验样品总RNA完整性检测24-25
• 2.2.2 样品总RNA浓度检测25-26
• 2.2.3 cDNA合成第一链质量检测26-27
• 2.3 小结27-28
• 3 潜在致病相关基因的选择及特异性引物的筛选28-39
• 3.1 材料与方法28-30
• 3.1.1 潜在致病相关基因28
• 3.1.2 引物设计28
• 3.1.3 引物的特异性验证28-30
• 3.2 结果与分析30-38
• 3.2.1 潜在致病相关基因筛选30
• 3.2.2 目的基因候选引物30-32
• 3.2.3 引物特异性验证32-38
• 3.3 小结38-39
• 4 玫烟色棒束孢入侵阶段潜在致病相关基因差异表达验证39-43
• 4.1 材料与方法39-40
• 4.1.1 供试虫源及菌株39
• 4.1.2 玫烟色棒束孢内参基因39
• 4.1.3 标准曲线的制备39
• 4.1.4 潜在致病相关基因的荧光定量PCR检测39-40
• 4.1.5 数据处理与分析40
• 4.2 结果与分析40-42
• 4.2.1 目的基因标准曲线40
• 4.2.2 玫烟色棒束孢入侵阶段潜在致病相关基因表达情况40-42
• 4.3 小结42-43
• 5 玫烟色棒束孢定殖及致死阶段潜在致病相关基因差异表达验证43-48
• 5.1 材料与方法43
• 5.1.1 供试虫源及菌株43
• 5.1.2 玫烟色棒束孢内参基因43
• 5.1.3 标准曲线的制备43
• 5.1.4 潜在致病相关基因的荧光定量PCR检测43
• 5.1.5 数据处理与分析43
• 5.2 结果与分析43-46
• 5.2.1 目的基因标准曲线43
• 5.2.2 玫烟色棒束孢定殖及致死阶段致病相关基因的表达情况43-46
• 5.3 小结46-48
• 6结论与讨论48-54
• 6.1 结论48
• 6.2 讨论48-54
• 6.2.1 参与玫烟色棒束孢侵染致病小菜蛾前期基因的功能分析48-50
• 6.2.2 参与玫烟色棒束孢侵染致病小菜蛾后期基因的功能分析50-53
• 6.2.3 有待于进一步研究的内容53-54
• 致谢54-55
• 参考文献55-60
• 附录60-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：1024250