木薯类受体胞质激酶基因MeBIK1的分离鉴定

发布时间：2017-10-15 11:04

  本文关键词：木薯类受体胞质激酶基因MeBIK1的分离鉴定

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【摘要】：木薯是热带地区重要的粮食作物,同时也是一种重要的能源作物。由黄单胞杆菌引起的细菌性枯萎病是世界各木薯主产国的检疫性病害,严重影响木薯产量的提高。先天免疫反应(innate immunity)是植物应答病原物的基础抗性,具有广谱性、持久性,是有效开展植物抗病育种的新选择。对木薯先天免疫相关基因的分离鉴定将有助于完善木薯与病原微生物互作理论知识,同时抗性新基因的获得也将为木薯抗病育种提供新的基因资源。本研究根据拟南芥PTI反应途径关键基因AtBIK1(LOC_ At2g39660)的氨基酸序列,对木薯基因组进行同源搜索,候选了木薯类受体蛋白激酶基因并通过表达分析、功能缺失性突变体遗传互补、转基因等途径对该基因的功能进行研究。取得的主要实验结果如下：1. 利用拟南芥已知研究结果,对木薯释放的基因组数据库(www.cassava.org)进行同源搜索,候选了木薯PTI途径类受体蛋白胞质激酶基因,序列分析结果表明,该基因cDNA全长1230 bp,所扩增的基因与已释放序列同源性100%,编码409个氨基酸,含有保守的激酶结构域,鉴于该基因与拟南芥AtBIK1高度同源,命名为MeBIK1.2. 拟南芥原生质体瞬时表达体系亚细胞定位结果表明,MeBIK1基因定位在细胞膜上。3. qRT-PCR结果表明,MeBIK1基因在未受刺激时表达量低,受到鞭毛蛋白flg22刺激后表达量显著提高,并在刺激后1h表达量最高,之后逐渐降低。4. 构建MeBIK1基因双元荧光素酶报告系统,利用拟南芥atbik1突变体开展遗传互补实验,结果表明,MeBIKl基因能恢复拟南芥atbik1突变体中减弱的PTI反应。5. 构建了MeBIKl基因的植物过量表达载体进行拟南芥转基因,经潮霉素多次筛选获得纯合子后进行抗病性测定,结果表明,过表达植株能提高转基因拟南芥对XamHN04(黄单胞杆菌)的抗性,但对PstDC3000的敏感性。6. 采用2,4-D和picloram不同浓度对木薯华南8号进行体细胞胚诱导实验,发现picloram 12 mg/L时体细胞胚的出胚率最高为83.3%。之后用picloram不同浓度分别诱导TMS60444、SC6、SC8、SC124和Arg7 5个木薯品种的体细胞胚、成熟胚以及愈伤组织,结果表明5个品种中TMS60444的出胚率最高达到89.2%,其次是SC8,为83.3%。7. 采用农杆菌介导的遗传转化法转化木薯FEC,设定了农杆菌菌液浓度和浸染时间两个转化条件,经潮霉素筛选后发现菌液浓度OD600=0.4、浸染时间为30 min时FEC的存活率最高。8. 采用gus染色对转基因植株进行检测结果表明,57株再生植株中有48株植株的的茎和叶都被染上蓝色,将染色阳性的植株进行基因组PCR检查,发现有均能扩增出400bp左右的条带,阳性率为84%.10.利用MeBIK1-gfp引物扩增经抗性筛选后4植株叶片基因组DNA,结果有2株扩增出了目的条带,阳性率率为50%。
【关键词】：木薯 MeBIK1 遗传互补 功能鉴定 遗传转化
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S533
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-22
• 1 木薯生产现状11-12
• 1.1 木薯栽培现状11
• 1.2 木薯的经济价值及用途11-12
• 1.3 病害是制约木薯产业发展的重要因素之一12
• 2 植物先天免疫反应12-17
• 2.1 病原物的PAMPs和植物的PRRs13-14
• 2.2 PAMPs激活的免疫信号通路14-15
• 2.3 BIKI在植物先天免疫的激活与调控中必不可少15-17
• 3 木薯的组织培养及遗传转化的研究进展17-20
• 3.1 木薯的组织培养17-19
• 3.1.1 分生组织培养18
• 3.1.2 成熟器官培养18-19
• 3.1.3 体细胞胚状体培养19
• 3.2 木薯的遗传转化19-20
• 3.2.1 农杆菌介导的木薯遗传转化20
• 3.2.2 基于FEC的转化体系20
• 4 本研究的目的和研究内容20-21
• 5 技术路线21-22
• 第二章 木薯类受体激酶基因MEBIK1的分离及在拟南芥中的功能鉴定22-39
• 1 材料与方法22-29
• 1.1 试验材料22-24
• 1.1.1 植物材料22
• 1.1.2 菌株及载体22
• 1.1.3 主要试剂22
• 1.1.4 仪器设备22
• 1.1.5 原生质体提取及转化所用试剂22-23
• 1.1.6 培养基23-24
• 1.2 实验方法24-29
• 1.2.1 木薯叶片总RNA的提取及反转录24
• 1.2.2 RT-PCR扩增MeBIK1基因的全长CDs序列24-25
• 1.2.3 候选基因的诱导表达分析25
• 1.2.4 载体构建25-26
• 1.2.5 氯化铯密度梯度离心法大量提取质粒26-27
• 1.2.6 拟南芥原生质体制备及亚细胞定位分析27-28
• 1.2.7 拟南芥同源基因缺失突变体的遗传互补28
• 1.2.8 转基因拟南芥的获得及鉴定28-29
• 1.2.9 转基因拟南芥植株的抗病性检测29
• 2 结果与分析29-37
• 2.1 木薯叶片总RNA提取29
• 2.2 候选基因MeBIK1编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶29-31
• 2.3 MeBIK1定位在细胞膜上31-32
• 2.4 MeBIK1基因受Flg22诱导表达32-33
• 2.5 MeBIK1能恢复拟南芥突变体的PTI反应33-34
• 2.6 转MeBIK1基因拟南芥的获得及表达检测34-35
• 2.7 转基因拟南芥抗病表型鉴定35-37
• 3 讨论37-39
• 3.1 MeBIK1是一个类受体胞质激酶37-38
• 3.2 MeBIK1在抗PstDC300和XamHN004中的表型不一致38-39
• 第三章 木薯遗传转化体系的构建及转MEBIK1基因植株的获得39-53
• 1 材料与方法39-42
• 1.1 材料39-40
• 1.1.1 植物材料39
• 1.1.2 菌株及载体39
• 1.1.3 药品试剂39
• 1.1.4 培养基39-40
• 1.2 方法40-42
• 1.2.1 木薯无菌苗的获得40
• 1.2.2 腋芽的诱导培养40
• 1.2.3 体细胞胚的诱导以及成熟40
• 1.2.4 不同浓度picloram诱导不同木薯品种体细胞胚的产生40-41
• 1.2.5 脆性胚性愈伤组织(FEC)的诱导41
• 1.2.6 植株再生41
• 1.2.7 报告基因pCAMBIA1301-gus及目的基因MeBIK的转化41
• 1.2.8 转化后植株的再生41-42
• 1.2.9 转基因植株的鉴定42
• 2 结果与分析42-51
• 2.1 不同浓度2,4-D和picloram对诱导体细胞胚的影响42-44
• 2.1.1 2,4-D的不同浓度对诱导体细胞胚的影响42-43
• 2.1.2 picloram的不同浓度对诱导体细胞胚的影响43-44
• 2.2 五个木薯品种在picloram不同浓度下体细胞胚的诱导情况44-45
• 2.3 诱导成熟脆性胚性愈伤FEC的最佳picloram浓度的筛选45-46
• 2.4 农杆菌菌液浓度和侵染时间对木薯FEC存活率的影响46
• 2.5 转化植株的再生46-48
• 2.6 转基因木薯植株的鉴定48-51
• 2.6.1 报告基因的gus染色及PCR检测48-49
• 2.6.2 目的基因MeBIK1的荧光检测49-50
• 2.6.3 目的基因MeBIK1的PCR检测50-51
• 3 讨论51-53
• 3.1 生长素浓度对木薯体细胞胚产量差异较大51
• 3.2 转化时间及菌液浓度对FEC存活率有较大影响51-53
• 第四章 结论53-54
• 参考文献54-59
• 附录59-63
• 附录一59
• 附录二59
• 附录三59-61
• 附录四61-63
• 发表的文章63
• 致谢63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1036747