一种新型硫酸软骨素AC外切酶的基因克隆及其催化特性研究

发布时间：2017-10-15 23:36

  本文关键词：一种新型硫酸软骨素AC外切酶的基因克隆及其催化特性研究

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【摘要】：糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)是一类在多种生物学过程中发挥重要作用的多糖,并且与多种疾病息息相关。硫酸软骨素AC外切酶(chondroitin sulfate AC lyase, ChnAC, EC 4.2.2.5)可以降解包括硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)和透明质酸(hyaluronic acid, HA)在内的多种GAGs,生成非还原端包含4-不饱和葡糖醛酸的相应二糖。研究发现,多种野生微生物可以表达ChnAC,这些酶的编码基因大部分已经确定。天然或者重组表达的微生物来源的ChnAC作为降解工具酶被并广泛的应用于GAGs糖链结构研究和序列分析。本课题的主要内容包括：1.本课题组此前从土壤中筛选到一株高产硫酸软骨素降解酶(chondroitin sulfate lyase, ChSase)的节杆菌属(Arthrobacter sp.)菌株SSAs-1。通过分子生物学手段克隆该菌株表达ChSase的编码基因AsChnAC.首先设计简并引物,PCR扩增得到中间部分基因序列；然后通过inverse PCR方法得到下游基因序列；通过Genome Walking技术得到上游基因序列；最后序列分析确定该基因起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG),确定编码ChSase的基因序列的开放阅读框架。2.实现AsChnAC基因在大肠杆菌表达系统中高效重组表达,并优化了该基因编码的蛋白的诱导和纯化条件。3.通过氨基酸残基序列同源比对分析和纯化酶分子底物特异性分析,确定本课题自节杆菌SSAs-1克隆获得的ChSase为硫酸软骨素AC外切酶ChnAC,并命名为AsChnAC。4.系统分析了该新型AsChnAC的酶学参数,以化学酶法合成的结构确定的寡糖系列底物首次确定了ChSase对底物糖链的酶解方向。尽管微生物ChnAC的底物特异性和蛋白质晶体结构已有一定的研究基础,但由于结构均一确定模式底物的缺乏,使其降解糖链的催化方向性仍然未知。本课题首次利用化学酶法寡糖合成技术制备了四种肝素-软骨素嵌合寡糖底物,通过电喷雾质谱(ESI-MS)技术分析了AsChnAC处理四种寡糖的降解产物的结构。实验结果表明,AsChnAC可以降解位于底物寡糖糖链还原端的-GalNAc-β1,4-GlcA-单位；然而当-GlcNAc-α14-GlcA-单位位于寡糖糖链的还原端时,却阻碍了AsChnAC降解寡糖糖链中间和非还原端的-GalNAc-β1,4-GlcA-单位。上述实验结果直接证明了ChnAC对底物的催化方向为从还原端向非还原端降解。本课题的结论深化了我们对AsChnAC催化模式的认识,对了解微生物来源的糖胺聚糖分解酶的研究具有重要的科学理论意义,而且相关成果可以直接指导AsChnAC在GAG结构分析、低分子量GAG制备等领域的应用,也为未来对该酶分子的定向进化获得功能特定突变体提供了理论基础。
【关键词】：糖胺聚糖 硫酸软骨素 硫酸软骨素AC外切酶 模式底物 催化方向
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;R91
【目录】：

• 摘要10-12
• ABSTRACTS12-14
• 符号说明14-16
• 第一章 前言16-23
• 1.1 硫酸软骨素16-18
• 1.1.1 糖胺聚糖16-17
• 1.1.2 硫酸软骨素的结构17
• 1.1.3 硫酸软骨素的应用17-18
• 1.2 硫酸软骨素降解酶18-20
• 1.2.1 糖胺聚糖降解酶18
• 1.2.2 硫酸软骨素降解酶的分类18
• 1.2.3 硫酸软骨素AC降解酶18-19
• 1.2.4 硫酸软骨素降解酶的应用19-20
• 1.2.5 硫酸软骨素降解酶的基因克隆和重组表达20
• 1.3 本实验的研究内容与意义20-23
• 1.3.1 编码硫酸软骨素降解酶未知基因序列的扩增20-21
• 1.3.2 新型硫酸软骨素降解酶的异源表达与纯化21
• 1.3.3 硫酸软骨素AC降解酶催化方向研究21-22
• 1.3.4 研究意义22-23
• 第二章 新型硫酸软骨素降解酶编码基因的扩增23-35
• 2.1 实验仪器、材料与试剂23
• 2.1.1 实验仪器23
• 2.1.2 材料与试剂23
• 2.2 实验方法23-28
• 2.2.1 菌株全基因组提取24
• 2.2.2 设计简并引物扩增部分目的基因24-25
• 2.2.3 利用反向PCR扩增下游基因序列25-26
• 2.2.4 应用Genome walking技术克隆剩余基因序列26-28
• 2.2.5 扩增全部目的基因28
• 2.3 实验结果28-33
• 2.3.1 中间部分目的基因的扩增29-30
• 2.3.2 下游目的基因的扩增30-31
• 2.3.3 上游目的基因的扩增31
• 2.3.4 克隆全部目的基因31-33
• 2.4 讨论33-35
• 第三章 新型硫酸软骨素降解酶的异源表达及性质研究35-52
• 3.1 实验仪器、材料与试剂35-36
• 3.1.1 仪器35
• 3.1.2 试剂35-36
• 3.2 实验方法36-42
• 3.2.1 目的基因的制备36
• 3.2.2 重组表达载体的构建36-38
• 3.2.3 重组蛋白的表达38
• 3.2.4 重组蛋白的纯化38-40
• 3.2.5 重组蛋白的活性验证40
• 3.2.6 重组蛋白的性质研究40-42
• 3.3 实验结果42-49
• 3.3.1 重组表达载体的构建42-44
• 3.3.2 重组蛋白的表达与纯化44
• 3.3.3 重组蛋白的活性验证44-46
• 3.3.4 重组蛋白的性质研究46-49
• 3.4 讨论49-52
• 3.4.1 基因工程菌的构建与筛选49-50
• 3.4.2 重组蛋白的表达与纯化50-51
• 3.4.3 AsChnAC底物适应性的分析及酶学性质研究51-52
• 第四章 催化方向的研究52-67
• 4.1 实验仪器、材料与试剂52
• 4.1.1 仪器52
• 4.1.2 试剂52
• 4.2 实验方法52-54
• 4.2.1 模式底物合成52-54
• 4.2.2 模式寡糖底物的降解54
• 4.3 实验结果54-65
• 4.3.1 三糖底物合成54-56
• 4.3.2 AsChnAC降解三糖产物分析56-57
• 4.3.3 HP-CS-六糖合成及AsChnAC降解六糖底物分析57-60
• 4.3.4 CS-HP-六糖合成及AsChnAC降解六糖底物分析60-62
• 4.3.5 总结62-65
• 4.4 讨论65-67
• 总结67-70
• 参考文献70-75
• 致谢75-76
• 攻读硕士期间发表的论文76-77
• 附录77-82
• 附录1 目的基因AsChnAC序列77-79
• 附录2 AsChnAC氨基酸残基序列79-82
• 附件82-90
• 学位论文评阅及答辩情况表90

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