棉花转录因子基因GhWRKY27a的分离及功能研究

发布时间：2017-10-17 21:20

  本文关键词：棉花转录因子基因GhWRKY27a的分离及功能研究

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【摘要】：棉花是我国重要的经济作物,但其产量和品质常受干旱、低温、盐碱以及病原菌侵染等多种逆境胁迫的影响。为了适应和抵御这些逆境胁迫,植物在长期进化的过程中,逐渐形成了一系列复杂的防御反应机制。其中,转录因子在这些防卫反应中起到了十分重要的作用。WRKY转录因子是植物所特有的一类转录因子,不仅参与调控植物的生长发育、衰老及物质代谢等一系列生理过程,还广泛参与植物对各种生物及非生物胁迫的应答过程。然而,相对于Ⅰ类和Ⅱ类WRKY转录因子,关于Ⅲ类WRKY转录因子生物学功能的研究仍较少。在本研究中,我们从棉花中分离得到一个Ⅲ类WRKY基因,命名为Gh WRKY27a,并对其在生物和非生物胁迫反应中的表达特性及生物学功能进行了一系列研究。具体结果如下:(1)Gh WRKY27a的c DNA序列全长为1513bp,包含1068bp的开放阅读框(ORF)、319bp的5'非编码区和126bp的3'非编码区。ORF编码一个含有356个氨基酸残基的多肽,预测其分子量为40.062k Da,p I值为5.46。氨基酸序列比对以及聚类分析表明,Gh WRKY27a属于第Ⅲ类WRKY转录因子。亚细胞定位分析结果表明Gh WRKY27a定位在细胞核中。(2)利用Plant CARE和PLACE数据库对Gh WRKY27a的启动子序列进行分析,得到一系列与胁迫应答相关的顺式作用元件。进一步对Gh WRKY27a的表达特性进行研究,发现Gh WRKY27a的表达可受干旱、高盐和低温等非生物胁迫,过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)、乙烯(ethylene,ET)等信号分子及立枯丝核菌(Rhizoctonia solani,R.solani)的诱导。(3)利用病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术,获得棉花Gh WRKY27a沉默植株。通过对其进行抗旱性检测,发现Gh WRKY27a的沉默能够提高植株对干旱胁迫的耐受力。此外,采用农杆菌介导的叶盘法转化本生烟,获得Gh WRKY27a超表达植株。Gh WRKY27a超表达植株对干旱胁迫十分敏感,且超表达植株的叶片具有较高的失水率。以上结果表明,Gh WRKY27a在植物对干旱胁迫的应答反应中起负调控作用。进一步研究发现,Gh WRKY27a的超表达能够抑制转基因植株干旱诱导的ABA累积,且破坏ABA介导的气孔关闭。(4)Gh WRKY27a超表达植株接种R.solani后,转基因植株比野生型植株具有更严重的发病表型。进一步研究发现,超表达Gh WRKY27a改变了转基因植株中防卫反应相关基因的表达量。由此推测,Gh WRKY27a可能在植物应对R.solani的侵染中起负调控作用。(5)在干旱胁迫和R.solani侵染后,我们发现转基因植株比野生型植株积累更多的活性氧,且抗氧化相关基因的表达水平降低。此外,转基因植株降低了对氧化胁迫的耐受性。这表明Gh WRKY27a可能通过增加活性氧的积累,增强对逆境胁迫的敏感性。
【关键词】：棉花 WRKY转录因子 干旱胁迫 立枯丝核菌侵染 脱落酸 活性氧
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S562
【目录】：

• 符号说明4-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-23
• 1.1 转录因子13-14
• 1.2 WRKY转录因子的起源与进化14-15
• 1.3 WRKY转录因子的结构特点15-17
• 1.4 WRKY转录因子的分类17
• 1.5 WRKY转录因子的生物学功能17-22
• 1.5.1 WRKY转录因子与非生物胁迫18-20
• 1.5.2 WRKY转录因子与生物胁迫20-22
• 1.5.3 WRKY转录因子与活性氧22
• 1.6 本研究的目的及意义22-23
• 2 材料与方法23-44
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 植物材料23
• 2.1.2 菌株与载体23
• 2.1.3 其他材料23
• 2.1.4 PCR引物23-25
• 2.2 实验方法25-44
• 2.2.1 棉花材料的培养及处理25-26
• 2.2.2 植物总RNA的提取26-28
• 2.2.2.1 CTAB法提取棉花植株总RNA26-27
• 2.2.2.2 利用试剂盒法快速提取棉花总RNA27
• 2.2.2.3 利用Trizol Kit提取烟草总RNA27-28
• 2.2.3 cDNA第一链的合成28
• 2.2.4 cDNA的纯化和加尾反应28-29
• 2.2.4.1 cDNA的纯化28-29
• 2.2.4.2 cDNA 5′末端加尾反应29
• 2.2.5 GhWRKY27a全长cDNA序列的获得29-32
• 2.2.5.1 GhWRKY27a中间片段的获得29-30
• 2.2.5.2 5'RACE获得 5'端序列30-31
• 2.2.5.3 3'RACE获得 3'端序列31-32
• 2.2.5.4 cDNA全长序列的获得32
• 2.2.6 植物基因组DNA的提取和纯化32-33
• 2.2.7 GhWRKY27a全长基因组序列的获取33-34
• 2.2.8 GhWRKY27a启动子序列的获得34
• 2.2.9 目的片段的回收34-35
• 2.2.10 目的片段与克隆载体的连接35
• 2.2.11 大肠杆菌超级感受态细胞的制备和转化35-36
• 2.2.11.1 Inoue法制备大肠杆菌超级感受态细胞35-36
• 2.2.11.2 大肠杆菌超级感受态细胞DH5α的转化36
• 2.2.12 大肠杆菌质粒的提取36
• 2.2.13 重组质粒的酶切验证36-37
• 2.2.14 实时荧光定量PCR检测目的基因的表达量37-38
• 2.2.15 植物表达载体的构建与转化38-39
• 2.2.15.1 植物表达载体的构建38
• 2.2.15.2 制备农杆菌感受态细胞38-39
• 2.2.15.3 农杆菌感受态细胞的转化39
• 2.2.15.4 农杆菌介导的瞬时侵染39
• 2.2.16 棉花VIGS沉默植株的获得39-40
• 2.2.17 GhWRKY27a超表达植株的获得40-41
• 2.2.17.1 农杆菌介导的叶盘法转化本生烟40
• 2.2.17.2 小量法提取烟草植株基因组DNA40-41
• 2.2.17.3 转基因烟草植株的鉴定41
• 2.2.18 转基因烟草渗透胁迫下的萌发率和根长测定41
• 2.2.19 干旱实验41
• 2.2.20 叶片失水率测定41-42
• 2.2.21 气孔开度测定42
• 2.2.22 ABA浓度测定42
• 2.2.23 氧化胁迫实验42
• 2.2.24 转基因植株的抗病分析42-43
• 2.2.24.1 PDA培养基的配制42
• 2.2.24.2 病原菌的活化42
• 2.2.24.3 病原菌的离体接种42-43
• 2.2.24.4 病原菌的活体接种43
• 2.2.25 组织化学染色分析43
• 2.2.25.1 3, 3'-二氨基联苯胺（3, 3'-diaminobenzidine, DAB）染色43
• 2.2.25.2 氮蓝四唑（nitroblue tetrazolium, NBT）染色43
• 2.2.26 网络信息资源43
• 2.2.27 生物学软件43-44
• 3 结果与分析44-67
• 3.1 棉花GhWRKY27a基因的分离44-48
• 3.1.1 GhWRKY27a中间片段的分离44
• 3.1.2 GhWRKY27a 5'片段和 3'片段的分离44-45
• 3.1.3 GhWRKY27a全长cDNA序列的分离45-46
• 3.1.4 GhWRKY27a全长cDNA序列分析46
• 3.1.5 GhWRKY27a氨基酸序列分析及其进化分析46-48
• 3.2 GhWRKY27a基因组序列的分离及分析48-49
• 3.3 棉花GhWRKY27a的亚细胞定位分析49-50
• 3.4 GhWRKY27a启动子序列的分离及其顺式作用元件的预测50-51
• 3.5 GhWRKY27a的表达模式分析51-54
• 3.5.1 GhWRKY27a的组织特异性分析51-52
• 3.5.2 GhWRKY27a在非生物胁迫下的表达模式52
• 3.5.3 GhWRKY27a在生物胁迫下的表达特性分析52
• 3.5.4 GhWRKY27a在多种信号分子处理下的表达模式52-54
• 3.6 GhWRKY27a沉默植株的获得及鉴定54-55
• 3.6.1 GhWRKY27a沉默载体的构建54
• 3.6.2 GhWRKY27a沉默植株的获得54-55
• 3.7 棉花GhWRKY27a沉默植株对干旱胁迫的抗性分析55-56
• 3.8 GhWRKY27a超表达植株的获得及鉴定56-58
• 3.8.1 GhWRKY27a超表达植株的获得56
• 3.8.2 GhWRKY27a超表达植株的鉴定56-58
• 3.9 GhWRKY27a超表达植株对干旱胁迫的抗性分析58-64
• 3.9.1 GhWRKY27a超表达植株对甘露醇引起的渗透胁迫的敏感性58-59
• 3.9.2 GhWRKY27a超表达植株对干旱胁迫的敏感性59-61
• 3.9.3 GhWRKY27a超表达植株对ABA不敏感61-62
• 3.9.4 超表达GhWRKY27a降低了转基因植株的抗氧化能力62-64
• 3.10 GhWRKY27a超表达植株对立枯丝核菌的抗性分析64-67
• 3.10.1 GhWRKY27a超表达植株对立枯丝核菌侵染的敏感性64
• 3.10.2 GhWRKY27a超表达植株在立枯丝核菌侵染下增加了活性氧的积累64-65
• 3.10.3 GhWRKY27a超表达植株在立枯丝核菌侵染下抗性相关基因的表达水平65-67
• 4 讨论67-71
• 4.1 GhWRKY27a属于Ⅲ类WRKY转录因子67
• 4.2 GhWRKY27a的亚细胞定位分析67-68
• 4.3 GhWRKY27a的表达受多种逆境胁迫及信号分子的诱导68
• 4.4 GhWRKY27a参与调控干旱胁迫反应68-69
• 4.5 GhWRKY27a参与调控抗病信号转导途径69-71
• 5 结论71-72
• 参考文献72-79
• 致谢79-80
• 攻读学位期间发表论文情况80

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