菜心硝转运蛋白基因NRTs的克隆及其表达特性分析

发布时间：2017-10-17 22:00

  本文关键词：菜心硝转运蛋白基因NRTs的克隆及其表达特性分析

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【摘要】：近几年随着蔬菜栽培中氮肥施用量的增加,蔬菜硝酸盐积累与氮素利用率降低的问题逐渐突出。硝态氮是植物吸收的主要氮源,根系对硝态氮的吸收主要是通过硝转运蛋白NRT进行的,其主要代表是低亲和硝转运蛋白NRT1和高亲和硝转运蛋白NRT2。NRT对硝态氮的吸收能力主要取决于其对硝态氮的亲和性,同时也受外界环境的影响。菜心(Brassica campestrisL.ssp.chinesis var.utilisTsen et Lee)是华南地区特产和栽培面积最大的蔬菜,是一种喜硝态氮的叶类蔬菜。目前关于菜心氮素吸收分子机理的研究较少,研究菜心氮素吸收规律及其与NRTs表达特性的相关性,对于揭示硝酸盐积累的分子机制具有重要意义。本试验在水培条件下对菜心氮素吸收能力以及NRTs基因表达进行研究。研究内容分为以下四个方面:(1)菜心硝转运蛋白基因BcNRT1;1,BcNRT1;2和BcNRT2;1的克隆与功能分析;(2)不同生长时期菜心的氮素吸收能力与NRTs基因表达特性分析;(3)不同氮源处理对菜心氮素吸收以及根系NRTs基因表达的影响;(4)铵硝混合条件下菜心的氮素吸收特性与NRTs基因表达特性分析。主要结果如下:1.利用RT-PCR法克隆得到了菜心BcNRT1;1,BcNRT1;2和BcNRT2;1三个硝转运蛋白基因,其ORF全长分别为1770bp,1638bp和1530bp。进化树分析结果表明BcNRT1;1和BcNRT1;2隶属于低亲和硝转运系统,BcNRT2;1隶属于高亲和硝转运系统。对BcNRT1;1,BcNRT1;2和BcNRT2;1编码的氨基酸序列分析表明,BcNRT1;1编码的氨基酸残基数为589个,相对分子质量为64.97kD,理论等电点为8.44,蛋白平均疏水性0.353;而BcNRT1;2的编码的氨基酸残基数为545个,相对分子质量为61.55kD,理论等电点为8.80,蛋白平均疏水性0.321;BcNRT2;1编码的氨基酸残基数为510个,相对分子质量为55.55kD,理论等电点为9.11,蛋白平均疏水性0.373。2.不同生长时期菜心对硝态氮的吸收能力具有显著差异,抽薹初期硝态氮吸收能力最强。BcNRT1;1主要在根系中表达,其在根系和叶片中的表达均是先上升后下降;BcNRT1;2营养生长时期在根系的表达量高于叶片,从抽薹初期开始,叶片的表达量超过根系。BcNRT2;1主要在根系中表达,其在根系中的表达随着生长时期先上升后下降,而叶片的表达量则是一直下降。不同生长时期菜心硝态氮吸收能力与根系中BcNRT1;1的表达量具有显著相关性,为0.778。3.菜心对硝态氮和铵态氮的吸收具有不同的特性。菜心对NO_3~-的吸收随着营养液硝态氮浓度的增加而增加,菜心植株总氮含量也随着硝态氮浓度的增加而增加。菜心对NH_4~+的吸收随着营养液铵态氮浓度的增加而有少量的增加,但是在铵态氮浓度低于2mM及高于4mM条件时对铵的吸收不随浓度的变化而出现显著的差异。在1~8mM的铵态氮浓度条件下菜心总氮含量没有显著差异。菜心三个NRTs基因的表达均受硝态氮诱导,BcNRT1;1与BcNRT1;2的被诱导幅度随着硝态氮浓度的增加而增加,而BcNRT2;1则相反。低浓度的铵态氮对BcNRT1;1与BcNRT1;2基因表达有诱导作用,但是随着铵态氮浓度的增加这种诱导作用减弱。铵态氮对菜心根系BcNRT2;1基因表达主要起抑制作用。4.铵硝比0:100、25:75和50:50三个处理中,铵硝比25:75的处理植株对总氮的吸收量显著高于另外两个处理。本试验中根系BcNRT1;1的表达量与菜心总氮吸收呈正相关关系,吸收24h的相关系数是0.919;BcNRT2;1表达与硝态氮吸收量关系更大,吸收24h的相关系数是0.863,而BcNRT1;2的表达量变化与氮素吸收量之间则没有明显的对应关系。5.铵硝比25:75与25:100两个处理在铵含量不变的情况下减少硝的含量,结果两个处理中菜心对硝态氮的吸收量没有发生显著的变化。0:100与25:100两个处理,在硝态氮含量不变的情况下铵的加入显著地抑制了植株对硝的吸收。综上所述,适量增铵促进菜心植株总氮吸收的升高,主要是适当比例铵硝混合(25:75)条件下菜心对铵的吸收补偿了对硝吸收的减少,造成总氮吸收的显著增加。不同处理中根系BcNRT1;1的表达量与菜心总氮吸收相关性最大。
【关键词】：菜心 氮素吸收 铵硝配比 NRTs基因 硝转运蛋白
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S634.5
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 缩略词表8-12
• 1 前言12-23
• 1.1 植物氮素营养概述12-13
• 1.2 植物对硝态氮的吸收及调控机制13-19
• 1.2.1 植物对NO_3~-的吸收过程13-14
• 1.2.2 低亲和NO_3~-转运蛋白基因14-15
• 1.2.3 高亲和NO_3~-转运蛋白基因15-17
• 1.2.4 植物硝转运蛋白基因表达调控17-19
• 1.3 植物吸收铵态氮的生理和分子机理19-20
• 1.3.1 植物对NH_4~+的吸收过程19-20
• 1.4 植物对铵硝混合营养的吸收利用20-21
• 1.4.1 铵硝混合营养对植物生长发育和产量的影响20
• 1.4.2 增铵条件下的氮素吸收20-21
• 1.5 本研究的目的和意义21-23
• 2 材料与方法23-33
• 2.1 菜心硝转运蛋白基因NRTs的克隆与生物信息学分析23-27
• 2.1.1 材料23
• 2.1.2 菜心RNA提取与cDNA第一链的合成23-24
• 2.1.3 目的基因片段的PCR扩增24-26
• 2.1.4 目的片段的回收纯化26
• 2.1.5 宿主菌E.coli DH5α 感受态细胞的制备26
• 2.1.6 目的片段与载体的连接26-27
• 2.1.7 测序27
• 2.1.8 生物信息学分析27
• 2.2 菜心不同生长时期根系硝态氮吸收能力与NRTs基因表达特性27-29
• 2.2.1 材料27-28
• 2.2.2 实时荧光定量28
• 2.2.3 硝态氮吸收量测定28-29
• 2.3 不同氮源处理对菜心氮素吸收及NRTs基因表达的影响29-30
• 2.3.1 材料29
• 2.3.2 不同形态和浓度氮素处理29
• 2.3.3 实时荧光定量29
• 2.3.4 菜心氮素吸收能力测定29-30
• 2.3.5 菜心植株全氮含量的测定30
• 2.4 不同铵硝配比对菜心氮素吸收与NRTs基因表达的影响30-31
• 2.4.1 材料30
• 2.4.2 不同铵硝配比处理30-31
• 2.4.3 营养液含量氮素测定31
• 2.4.4 实时荧光定量31
• 2.5 等铵减硝及等硝增铵对菜心氮素吸收与NRTs基因表达的影响31-33
• 2.5.1 材料31
• 2.5.2 等铵减硝及等硝增铵试验处理31-32
• 2.5.3 营养液含量氮素测定32
• 2.5.4 荧光定量32-33
• 3 结果与分析33-59
• 3.1 菜心硝转运蛋白基因NRTs的克隆与生物信息学分析33-39
• 3.1.1 BcNRT1;1，BcNRT1;2 和BcNRT2;1 的克隆33-34
• 3.1.2 BcNRT1;1，BcNRT1;2 和BcNRT2;1 阳性克隆的鉴定34
• 3.1.3 BcNRT1;1，，BcNRT1;2 和BcNRT2;1 核苷酸序列分析34
• 3.1.4 BcNRT1;1，BcNRT1;2 和BcNRT2;1 基因及推导氨基酸序列分析34-36
• 3.1.5 BcNRT1;1，BcNRT1;2 和BcNRT2;1 的蛋白结构分析36-39
• 3.2 菜心不同生长时期硝态氮吸收能力与NRTs基因表达特性39-42
• 3.2.1 菜心不同生长时期根系重量与硝态氮吸收能力39-40
• 3.2.2 菜心不同生长时期根系与叶片中NRTs基因表达情况40-42
• 3.3 不同氮源处理对菜心氮素吸收及NRTs基因表达的影响42-49
• 3.3.1 菜心对不同浓度硝态氮的吸收42-43
• 3.3.2 不同浓度硝态氮条件下NRTs基因的表达43-45
• 3.3.3 不同浓度硝态氮条件下菜心总氮含量45
• 3.3.4 菜心对不同浓度铵态氮的吸收45-47
• 3.3.5 不同浓度铵态氮条件下NRTs基因的表达47-49
• 3.3.6 不同浓度铵态氮条件下菜心总氮含量49
• 3.4 不同铵硝配比对菜心氮素吸收与NRTs基因表达的影响49-52
• 3.4.1 不同铵硝配比对菜心氮素吸收49-50
• 3.4.2 不同铵硝配比对菜心NRTs基因表达的影响50-52
• 3.5 等铵减硝及等硝增铵对菜心氮素吸收与NRTs基因表达的影响52-59
• 3.5.1 等铵减硝条件下菜心氮素吸收52-53
• 3.5.2 等铵减硝条件下菜心NRTs基因表达53-55
• 3.5.3 等硝增铵条件下菜心氮素吸收55-56
• 3.5.4 等硝增铵条件下菜心NRTs基因表达56-59
• 4 讨论59-67
• 4.1 菜心硝转运蛋白基因NRT1s的克隆59
• 4.2 菜心不同生长时期硝态氮吸收能力及NRTs基因表达特性59-62
• 4.2.1 不同生长时期根系氮素吸收59-60
• 4.2.2 不同生长时期NRTs基因主要在根系起作用60-61
• 4.2.3 不同生长时期菜心硝态氮吸收与NRTs基因表达的关系61-62
• 4.3 不同氮源处理对菜心氮素吸收及NRTs基因表达的影响62-64
• 4.3.1 菜心对不同形态与浓度氮素的吸收62-63
• 4.3.2 不同氮素形态与浓度对菜心NRTs基因表达的影响63-64
• 4.4 铵硝混合条件下菜心的氮素吸收64-66
• 4.5 等铵减硝及等硝增铵对菜心氮素吸收的影响66-67
• 5 结论67-68
• 致谢68-69
• 参考文献69-77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1051260