鸡传染性法氏囊病病毒NB株VP2成熟蛋白基因在毕赤酵母中的表达

发布时间：2017-10-18 07:07

  本文关键词：鸡传染性法氏囊病病毒NB株VP2成熟蛋白基因在毕赤酵母中的表达

  更多相关文章： 传染性法氏囊病病毒 VP2成熟蛋白 毕赤酵母

【摘要】：传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)感染鸡导致传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD),主要以侵害雏鸡淋巴组织,特别是中枢免疫器官——法氏囊,导致机体的免疫抑制。近年来,由于各地IBDV变异株、超强毒株的出现,使该病出现新的特点,传统疫苗免疫不能够进行有效防控。VP2是IBDV主要结构蛋白,包含主要保护性抗原表位。因此,VP2重组蛋白的表达能够为IBDV的防治和诊断试剂的开发提供理论依据和技术支撑。本研究根据GenBank中已发表的IBDV NB株VP2蛋白基因序列,结合蛋白成熟过程中VP2的裂解位点和抗原集中区的分析,设计合成VP2成熟蛋白基因引物,以IBDV VP2的cDNA为模板,PCR扩增VP2成熟片段,并与pMD18-T-simple载体连接,构建pMD-VP2重组克隆质粒,转化至DH5α,通过菌液PCR、双酶切和基因测序筛选阳性克隆。然后,利用限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ,双酶切阳性重组克隆质粒pMD-VP2、真核表达载体pPICZαC,回收目的基因,T4 DNA连接酶进行连接,构建pPICZαC-VP2真核重组表达质粒,转化至DH5α。利用菌液PCR、双酶切和基因测序筛选阳性重组表达质粒,成功构建真核表达质粒,命名为pPICZαC-VP2,PmeⅠ线性化阳性重组表达质粒,电转化法转化至毕赤酵母X-33中。ZeocinTM抗性筛选和菌液PCR,筛选获得阳性重组子,接种于BMMY培养基后用甲醇进行诱导培养,SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定重组蛋白。研究结果显示,扩增出长度为1323bp的VP2成熟蛋白基因。甲醇诱导重组真核表达质粒,SDS-PAGE检测显示在60KDa处有一条比理论值偏大的条带;Western blotting鉴定,重组蛋白能够与IBDV阳性血清特异性结合。以上研究结果表明,本研究成功获得了IBDV VP2重组蛋白。
【关键词】：传染性法氏囊病病毒 VP2成熟蛋白 毕赤酵母
【学位授予单位】：河南科技学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 缩略词表8-10
• 摘要10-11
• ABSTRACT11-12
• 第一章 文献综述12-22
• 1 IBD临床症状与致病机理12-13
• 1.1 IBD临床症状12
• 1.2 IBDV致病机理12-13
• 2 IBDV基因组结构13
• 3 IBDV衣壳蛋白13-15
• 3.1 VP2蛋白13-14
• 3.2 VP3蛋白14
• 3.3 VP4蛋白14-15
• 3.4 VP5蛋白15
• 3.5 VP1蛋白15
• 4 IBDV VP2抗原结构的变异15-16
• 5 IBDV疫苗研究进展16-17
• 5.1 传统IBDV疫苗16
• 5.2 基因工程苗16-17
• 6 IBDV VP2蛋白在不同表达系统的表达17-18
• 6.1 IBDV VP2在大肠杆菌表达系统的表达17
• 6.2 IBDV VP2在杆状病毒表达系统的表达17-18
• 6.3 IBDV VP2在毕赤酵母表达系统的表达18
• 7 存在问题及防治前景18-19
• 8 研究目的与意义19-22
• 第二章 IBDV NB株VP2成熟蛋白基因在毕赤酵母中的表达22-60
• 1 材料22-29
• 1.1 菌种和质粒22
• 1.2 试剂盒22-23
• 1.3 抗体23
• 1.4 酶类及其它相关试剂23-24
• 1.5 主要仪器设备24-25
• 1.6 主要试剂的配制25-27
• 1.7 蛋白凝胶电泳及Western blotting缓冲液27-29
• 2 方法29-43
• 2.1 IBDV VP2基因的扩增29-32
• 2.2 IBDV NB株VP2基因重组克隆质粒的构建32-36
• 2.3 IBDV NB株VP2基因毕赤酵母表达载体构建36-39
• 2.4 重组阳性质粒pPICZαC-VP2转化X-33酵母菌39-43
• 3 结果与分析43-53
• 3.1 IBDV VP2基因片段的PCR扩增43
• 3.2 回收纯化VP2基因43-44
• 3.3 IBDV NB株VP2基因克隆载体的构建及鉴定44-45
• 3.4 重组表达质粒的构建45-48
• 3.5 重组质粒pPICZαC-VP2的线性化鉴定48-49
• 3.6 重组酵母菌菌液PCR鉴定49-50
• 3.7 表达产物的分析及鉴定50-53
• 4 讨论53-60
• 4.1 引物设计53
• 4.2 抗原集中区对抗原活性的影响53
• 4.3 VP2重组蛋白的检测53-54
• 4.4 酵母表达系统54
• 4.5 影响外源基因在毕赤酵母中表达的几个因素54-60
• 全文结论60-62
• 参考文献62-70
• 附录A 表达载体pPICZαC的物理图谱70-72
• 附录B 表达载体pPICZαC的多克隆位点72-74
• 攻读学位期间取得的研究成果74-76
• 致谢76

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 蔡梅红,曹瑞兵,周斌,谈国蕾,杨松,陈溥言;鸡γ干扰素成熟蛋白基因的表达及其产物抗病毒活性测定[J];中国病毒学;2004年01期

2 任桂萍,李景鹏,许丽娜,李洪涛,藏玉婷,王君伟;鸭α干扰素成熟蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J];中国免疫学杂志;2005年05期

3 郑兰兰;贾云飞;崔保安;陈红英;魏战勇;陈瑞亮;;猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测[J];生物工程学报;2008年02期

4 王志亮,王长杰,吴晓东;中国黄牛PrP~c成熟蛋白基因的克隆和序列分析[J];中国动物检疫;2002年04期

5 孔娜;田夫林;兰邹然;杨林;冯涛;梁成珠;赵宏坤;;H5亚型AIV的HA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因的杆状病毒共表达载体的构建[J];西南农业学报;2008年05期

6 陈红英;崔保安;夏平安;李新生;杨明凡;郑兰兰;;麻鸭IL-18成熟蛋白基因的克隆、表达及其表达产物的生物学活性检测[J];农业生物技术学报;2007年04期

7 温纳相,陈瑞爱,裴仉福,唐满华,金晓芹,魏志清,朱文冠;新兴猪IL-18成熟蛋白基因的克隆与序列分析[J];中国兽医科技;2005年01期

8 张永红;王长法;杨少华;高运东;王洪梅;李景鹏;仲跻峰;;鲁西黄牛α干扰素成熟蛋白基因的克隆及序列分析[J];动物医学进展;2007年02期

9 王振国,金宁一,张洪勇,尹革芬,葛淑敏;鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆及分子进化分析[J];生物技术通讯;2004年02期

10 田兆菊;郑玉姝;胡敬东;赵宏坤;;牛IL-18成熟蛋白基因在昆虫细胞中的表达及其活性[J];细胞与分子免疫学杂志;2007年03期

中国重要会议论文全文数据库 前4条

1 刘文强;赵宏坤;高运东;仲跻峰;;奶牛白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆和原核表达[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集[C];2005年

2 刘文强;赵宏坤;高运东;仲跻峰;;奶牛白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆和原核表达[A];第六届全国会员代表大学暨第11次学术研讨会论文集（下）[C];2005年

3 龚永强;程安春;汪铭书;杨梅;张瑶;陈斌;;鸭IFN-α成熟蛋白基因原核表达、产物纯化和复性关键技术及其抗病毒活性[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集（下册）[C];2008年

4 龚永强;程安春;汪铭书;杨梅;张瑶;陈斌;;鸭IFN-α成熟蛋白基因原核表达、产物纯化和复性关键技术及其抗病毒活性[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会论文集[C];2007年

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 胡敬东;鸡白细胞介素18成熟蛋白基因克隆与表达的研究[D];山东农业大学;2004年

2 田兆菊;牛IL-18成熟蛋白基因的表达、生物学活性测定及其单克隆抗体的制备[D];山东农业大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前4条

1 韩玉婷;鸡传染性法氏囊病病毒NB株VP2成熟蛋白基因在毕赤酵母中的表达[D];河南科技学院;2016年

2 潘蔚绮;鸡白细胞介素18成熟蛋白基因克隆、表达及多克隆抗体制备[D];东北农业大学;2003年

3 马芳;卢氏鸡IFN-γ成熟蛋白基因的克隆与原核表达产物处理方法研究[D];河南科技大学;2013年

4 孔娜;H5亚型AIV HA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因重组杆状病毒表达载体的构建及其表达[D];山东农业大学;2008年

，

本文编号：1053614