番茄SlMADS23-like基因的克隆及功能研究

发布时间：2017-10-18 11:08

  本文关键词：番茄SlMADS23-like基因的克隆及功能研究

  更多相关文章： MADS-box基因 番茄 SlMADS23-like 叶绿素 非生物胁迫

【摘要】：番茄是茄科一年生草本植物在新鲜果蔬以及加工产业中是一种重要的模式作物。由于番茄生长周期短,表型易观察,基因组相对较小并且像其他茄科植物一样存在相同的保守的基因组结构,因此它被认为是茄科植物研究果实的一个代表性的种类。MADS-box基因作为重要的转录调控因子,在生物体中的不同部位以及不同生长发育阶段都有不同程度的表达。在动物中与心肌发育有关;在真菌中起信息素应答作用;在植物中调控花器官的形成及发育,开花时间,果实成熟及脱落,根、茎、叶的发育,同时MADS-box转录因子也参与植物的抗逆过程。本研究通过NCBI数据库对基因筛选,分离并克隆出番茄SlMADS23-like基因,进而开展了番茄SlMADS23-like基因的生物信息学分析,组织特异性分析,沉默转基因番茄的培育等研究,其研究内容及获得的主要结果如下:1.生物信息学分析:该基因的开放阅读框为720bp,编码239个氨基酸,分子量为27.596kD,等电点为9.84。SlMADS23-like蛋白的疏水的平均值(GRAVY):-0.804,脂溶指数(aliphatic index)为86.86,表明SlMADS23-like蛋白为亲水性脂溶蛋白。其不稳定系数预测为55.51,因此推被定为是不稳定的蛋白。二级结构预测52.30%的α螺旋,6.28%的β折叠,25.10%的无规则卷曲以及16.32%的延伸链。亚细胞定位预测SlMADS23-like属于跨膜蛋白。2、以番茄的看家基因SlCAC(登录号:SGN-U314153)作内参,采用实时荧光定量PCR方法检测SlMADS23-like基因的表达模式。结果显示,该基因在番茄的各个组织中均有表达,尤其在幼叶,成熟叶以及青果时期(IMG,MG)表达量比较高,但在果实成熟的各时期表达量比较低,并呈现出一个表达量下降的趋势。3、为了进一步揭示该基因的生物学功能,构建了SlMADS23-like基因的沉默载体,利用农杆菌介导的方法将其成功导入到野生型番茄中,进而通过NPTⅡ阳性菌株的检测和实时定量RT-PCR技术,获得了3个沉默效率达到90%以上的沉默转基因的番茄株系。4、SlMADS23-like基因沉默株系呈现的表型为:转基因株系的成熟叶片(ML)以及青果时期的果实(IMG、MG)与野生型相比绿色变浅,为验证这一表型,我们测定了成熟叶以及青果(IMG、MG)的叶绿素的含量,结果表明转基因株系与野生型相比,其成熟叶以及青果(IMG、MG)中的叶绿素含量降低。对叶绿素相关的基因(DCL、GLK1、GLK2)的表达量进行分析,结果表明,转基因株系的青果(IMG、MG)与野生型相比,这几个基因的表达明显下调。5、非生物胁迫(盐处理,脱水处理,高低温处理):在盐处理中,该基因在根中表达量非常低,但在叶片中表达量较高;高温诱导时,SlMADS23-like的表达量在12h达到最高值,而在低温诱导时,SlMADS23-like的表达量在24h达到最大;脱水处理时,SlMADS23-like的表达量在4h的时候达到最高,之后到8h有小幅度的下调,而后在8h-24h又有明显上升的趋势。也就是说,除盐处理中SlMADS23-like在叶片中的表达基本没有受到诱导之外,其他处理都对SlMADS23-like的表达有不同程度的诱导作用,其中叶盐诱导和冷处理尤为明显。在对幼苗发芽敏感性实验中,转基因株系要比野生型对ABA敏感,而在盐溶液的敏感性则相反。我们通过以上结果可以猜测SlMADS23-like转基因株系极可能存在抗逆性。6、选取沉默效率达90%以上的两个株系分别进行了盐胁迫和冷处理。观察到RNAi3-3,RNAi4-1与野生型相比均表现出抗盐、抗冷的表型,为进一步验证这个表型,我们检测了盐胁迫相关基因(PR1、PR5、CAT1、CAT2、ER5、TAS14等)和与冷处理相关的基因Cat2、CBF1和Cor)在分子水平上的变化,结果表明,与野生型相比,转基因株系中盐胁迫相关基因(PR1、PR5、CAT1、CAT2、ER5、TAS14等)表达均出现不同程度的上调,而冷处理相关的基因(Cat2、CBF1和Cor)表达则均出现不同程度的下调。综上所述,本研究通过对番茄SlMADS23-like基因在番茄中的功能及其分子调控机理进行了探究与分析,发现SlMADS23-like基因可能在番茄中对叶绿素合成途径有调控作用,同时我们对SlMADS23-like基因的非生物胁迫响应中的功能和机制进行了初步的探索和分析,这对全面阐明SlMADS23-like基因在植物中的功能和机理以及日后它们可能在基因工程中的应用奠定了基础。
【关键词】：MADS-box基因 番茄 SlMADS23-like 叶绿素 非生物胁迫
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 缩略词表11-12
• 1 绪论12-26
• 1.1 课题的国内外研究进展12-21
• 1.1.1 MADS-box基因的分布12
• 1.1.2 MADS-box基因的命名12-13
• 1.1.3 MADS-box基因的分类及结构13-14
• 1.1.4 MADS-box基因的功能14-19
• 1.1.5 番茄中MADS-box基因的研究19-21
• 1.2 植物非生物胁迫21-22
• 1.3 植物非生物胁迫应答相关基因的研究22-23
• 1.4 MADS-box基因在植物抗逆性中的研究23
• 1.5 课题研究的提出和研究意义23-24
• 1.6 研究内容与技术路线24-25
• 1.6.1 研究内容24-25
• 1.6.2 技术路线25
• 1.7 课题的创新点25-26
• 2 SlMADS23-like基因的克隆26-38
• 2.1 实验材料、试剂26-29
• 2.1.1 材料26
• 2.1.2 试剂26-29
• 2.2 仪器与设备29
• 2.3 方法29-35
• 2.3.1 番茄总RNA的提取29-30
• 2.3.2 cDNA的合成30-31
• 2.3.3 SlMADS23-like基因的引物设计31
• 2.3.4 SlMADS23-like基因的片段扩增及纯化31-32
• 2.3.5 SlMADS23-like基因与连接T载体32-35
• 2.4 结果与分析35-37
• 2.4.1 SlMADS23-like基因的片段扩增35-36
• 2.4.2 pMD18-T-SlMADS23-like重组子的筛选及验证36
• 2.4.3 SlMADS23-like基因片段测序36-37
• 2.5 小结37-38
• 3 SlMADS23-like基因的生物信息学分析38-46
• 3.1 方法38
• 3.1.1 SlMADS23-like蛋白的一级结构38
• 3.1.2 SlMADS23-like蛋白的二级结构38
• 3.1.3 SlMADS23-like蛋白的理化分析及亚细胞定位预测38
• 3.1.4 SlMADS23-like与其他MADS-box蛋白的序列比对38
• 3.1.5 SlMADS23-like的进化树分析38
• 3.2 结果与分析38-44
• 3.2.1 SlMADS23-like蛋白的一级结构38-41
• 3.2.2 SlMADS23-like蛋白的二级结构41
• 3.2.3 SlMADS23-like蛋白的理化性质分析41-42
• 3.2.4 SlMADS23-like蛋白与其他MADS-box蛋白的同源比对42-43
• 3.2.5 SlMADS23-like蛋白与其他MADS-box蛋白的进化树分析43-44
• 3.3 小结44-46
• 4 SlMADS23-like基因的表达模式分析46-50
• 4.1 材料和试剂46
• 4.1.1 材料46
• 4.1.2 试剂46
• 4.2 仪器46
• 4.3 方法46-47
• 4.3.1 植物组织样品的收集46-47
• 4.3.2 番茄总RNA的提取47
• 4.3.3 SlMADS23-like基因的q RT-PCR引物的设计47
• 4.3.4 SlMADS23-like基因的表达模式分析47
• 4.4 SlMADS23-like基因在番茄组织中的表达模式分析47-48
• 4.5 小结48-50
• 5 SlMADS23-like基因的RNAi沉默载体的构建50-62
• 5.1 材料50-52
• 5.2 仪器和设备52
• 5.3 方法52-58
• 5.3.1 SlMADS23-like基因沉默载体的构建52
• 5.3.2 SlMADS23-like基因沉默片段的克隆52-53
• 5.3.3 pHANNIBAL-SlMADS23-likei载体的构建53-56
• 5.3.4 pBIN19-SlMADS23-likei沉默终载体的构建56-58
• 5.4 结果与分析58-61
• 5.4.1 pHANNIBAL-SlMADS23-likei载体的构建58-60
• 5.4.2 pBIN19-SlMADS23-likei沉默终载体的构建60-61
• 5.5 小结61-62
• 6 SlMADS23-like基因RNAi沉默载体转化62-74
• 6.1 材料、试剂和培养基62-65
• 6.1.1 材料62
• 6.1.2 试剂62-63
• 6.1.3 实验所用的培养基63-65
• 6.2 仪器设备65-66
• 6.3 方法66-71
• 6.3.1 RNAi沉默菌株和农杆菌的结合转移66-67
• 6.3.2 SlMADS23-like基因沉默载体转化番茄67-68
• 6.3.3 SlMADS23-like基因沉默的转基因番茄的培养68-69
• 6.3.4 SlMADS23-like基因阳性沉默的转基因番茄株系的PCR筛选69-70
• 6.3.5 SlMADS23-like基因在沉默转基因番茄株系中的表达检测及筛选70-71
• 6.4 结果与分析71-73
• 6.4.1 培育SlMADS23-like基因沉默转基因番茄株系71
• 6.4.2 SlMADS23-like基因阳性沉默转基因番茄株系的PCR筛选71-72
• 6.4.3 SlMADS23-like基因在沉默转基因番茄株系中的表达检测72-73
• 6.5 小结73-74
• 7 SlMADS23-like在番茄中RNAi沉默株系的表型观察及分析74-80
• 7.1 材料与试剂74
• 7.1.1 材料74
• 7.1.2 试剂74
• 7.2 仪器与设备74
• 7.3 方法74-75
• 7.3.1 SlMADS23-like基因沉默转基因番茄叶片的表型及叶片叶绿素含量的测定74-75
• 7.3.2 SlMADS23-like基因沉默转基因番茄青果时期的表型及青果时期叶绿素含量的测定75
• 7.3.3 SlMADS23-like基因沉默转基因番茄青果时期叶绿素相关基因检测75
• 7.4 结果与分析75-78
• 7.4.1 SlMADS23-like基因转基因番茄叶片的表型及叶片叶绿素含量的测定75-76
• 7.4.2 SlMADS23-like基因转基因番茄青果时期的表型及青果时期叶绿素含量的测定76-77
• 7.4.3 SlMADS23-like基因转基因番茄青果时期叶绿素相关基因检测77-78
• 7.5 小结78-80
• 8 SlMADS23-like基因的非生物胁迫实验设计及分析80-94
• 8.1 材料和方法80-84
• 8.1.1 材料80
• 8.1.2 试剂80
• 8.1.3 SlMADS23-like基因在AC中的非生物胁迫处理实验80
• 8.1.4 SlMADS23-like基因的种子在ABA下的发芽率80-81
• 8.1.5 SlMADS23-like基因发芽种子对盐胁迫和ABA敏感度的实验81
• 8.1.6 SlMADS23-like基因转基因植株的非生物胁迫处理实验81-84
• 8.2 结果与分析84-92
• 8.2.1 SlMADS23-like基因在AC中的非生物胁迫处理实验84-85
• 8.2.2 SlMADS23-like基因的种子在ABA下的发芽率85
• 8.2.3 SlMADS23-like基因幼苗对盐胁迫和ABA敏感度的实验85-87
• 8.2.4 SlMADS23-like基因转基因植株的非生物胁迫处理实验87-92
• 8.3 小结92-94
• 9 讨论94-98
• 9.1 SlMADS23-like在番茄中参与调节叶片与青果时期的叶绿素积累量的功能94
• 9.2 SlMADS23-like转基因幼苗对ABA与盐溶液的敏感性研究94-95
• 9.3 SlMADS23-like基因在非生物胁迫中的功能95
• 9.4 SlMADS23-like可能参与调控多个胁迫相关基因的表达95-98
• 10 结论与展望98-100
• 10.1 结论98-99
• 10.2 展望99-100
• 致谢100-102
• 参考文献102-114
• 附录114
• A. 作者硕士期间发表的论文114
• B. 作者在攻读硕士学位期间参与的科研项目114

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