番茄SlWHY2基因的克

发布时间：2017-10-18 21:38

  本文关键词：番茄SlWHY2基因的克隆、表达和功能分析

  更多相关文章： 转基因烟草 SlWHY2 干旱胁迫 抗病 活性氧

【摘要】：植物在整个生长过程中,不可避免的会受到来自外界环境因子的各种刺激,如干旱、盐渍和低温等非生物胁迫及病虫侵害等。植物自身在长期的进化过程中形成了抵抗各种生物胁迫和非生物胁迫的防御机制。干旱胁迫作为我国北方地区常见的非生物胁迫,影响番茄的生长发育,表现在形态结构、生理和生化方面的变化,最终造成减产。此外,病虫侵害也是影响番茄正常生长发育的因素之一。WHIRLY转录因子作为植物体内特有的一类转录因子,可以通过响应干旱及病害的刺激,调控编码不同抗氧化酶基因的表达来调控酶活性,调控胁迫相关基因及抗病相关基因的表达来增强植物的抗旱性和抗病性。在本试验中克隆得到番茄WHIRLY转录因子SlWHY2基因,以转基因烟草作为试验材料,研究了SlWHY2转基因烟草在干旱胁迫下对活性氧的清除能力及其在抗病等方面的影响。本试验主要结果如下:(1)据NCBI得到该转录因子的mRNA序列,GenBank编码号:XM_010314783。SlWHY2全长1162bp,开放阅读框为726bp,编码241个氨基酸。(2)利用qRT-PCR对SlWHY2在番茄中表达特性分析表明,SlWHY2基因在叶片中的表达量高于其他组织;转录水平受聚乙二醇,氯化钠,水杨酸和过氧化氢的诱导表达。此外,SlWHY2的表达还受到青枯假单胞菌的诱导。(3)构建了SlWHY2的pBI121载体,转化野生型烟草,获得转基因烟草植株,通过PCR和qRT-PCR的方法筛选过表达植株,从中选取不同表达量的三个株系(OE-1,OE-3,OE-5)作为后续试验材料。(4)在正常的生长条件下,野生型与转基因烟草植株表型无明显差异。在干旱胁迫条件下,转基因株系幼苗及成苗的生长状态要优于野生型。DAB、NBT染色结果显示,干旱处理后,野生型叶片颜色深于转基因烟草,H2O2和O2·-含量测定结果进一步表明野生型烟草的活性氧积累量高于转基因烟草,且转基因烟草的酶活性及相关酶基因表达水平均高于野生型。这说明SlWHY2过表达提高了烟草抗氧化能力,缓解活性氧对植株的氧化毒害作用。(5)测定干旱处理后转基因烟草和野生型叶片的相对含水量、相对电导率、丙二醛以及游离脯氨酸的含量,结果表明野生型植株的相对电导率和丙二醛含量明显高于转基因株系,而相对含水量和游离脯氨酸含量则低于转基因烟草。试验进一步说明过表达SlWHY2提高烟草的抗渗透胁迫能力。(6)用青枯假单胞菌分别喷施、注射过表达和野生型烟草后,通过DAB和台盼蓝染色发现转基因烟草过氧化氢积累量及细胞死亡数均低于野生型烟草,通过qRT-PCR检测病程相关基因(PR1和PR2)表达水平,发现在转基因烟草中的表达水平明显高于野生型烟草。说明过表达SlWHY2烟草可能通过水杨酸依赖途径提高对活体病原菌的抗性。
【关键词】：转基因烟草 SlWHY2 干旱胁迫 抗病 活性氧
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S641.2
【目录】：

• 符号说明4-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-22
• 1.1 干旱对植物的伤害12-13
• 1.1.1 干旱对植物生物膜系统的影响12
• 1.1.2 干旱胁迫对植物生长的影响12-13
• 1.1.3 干旱对植物代谢的影响13
• 1.2 抗旱生理机制13-15
• 1.2.1 活性氧产生及抗氧化系统的作用13-15
• 1.2.2 渗透调节15
• 1.3 WHIRLY转录因子研究进展15-20
• 1.3.1 WHIRLY蛋白分子结构16
• 1.3.2 WHIRLY蛋白晶体结构16-17
• 1.3.3 WHIRLY转录因子在植物中的分布17-18
• 1.3.4 WHIRLY蛋白功能18-20
• 1.4 本研究的目的意义20-22
• 2 材料与方法22-38
• 2.1 试验材料22-25
• 2.1.1 植物材料22
• 2.1.2 材料处理22
• 2.1.3 菌株与载体22
• 2.1.4 酶与各种生化试剂22-23
• 2.1.5 PCR引物23-24
• 2.1.6 营养液和培养基配方24-25
• 2.2 试验方法25-38
• 2.2.1 植物总RNA的提取25-26
• 2.2.2 c DNA第一条链的合成26
• 2.2.3 番茄Sl WHY2基因的克隆26-27
• 2.2.4 目的片段的回收27-28
• 2.2.5 真核表达载体构建28-31
• 2.2.5.1 正义克隆载体构建28
• 2.2.5.2 大肠杆菌DH5α 感受态的制备28-29
• 2.2.5.3 转化及克隆筛选29
• 2.2.5.4 大肠杆菌质粒DNA的提取29-30
• 2.2.5.5 正义表达载体构建30
• 2.2.5.6 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞制备30-31
• 2.2.5.7 农杆菌转化31
• 2.2.6 农杆菌介导的烟草转化31-32
• 2.2.7 转基因烟草植株的PCR检测32-34
• 2.2.7.1 CTAB法提取叶片基因组DNA32
• 2.2.7.2 过表达植株的PCR筛选32-33
• 2.2.7.3 转录水平的鉴定33
• 2.2.7.4 实时荧光定量PCR33-34
• 2.2.8 转基因株系的抗逆试验34
• 2.2.8.1 烟草抗干旱萌发试验34
• 2.2.8.2 烟草幼苗干旱胁迫处理34
• 2.2.8.3 烟草成苗胁迫处理34
• 2.2.9 生理指标测定34-38
• 2.2.9.1 酶活性测定34-35
• 2.2.9.2 氧自由基的测定35
• 2.2.9.3 过氧化氢含量测定35-36
• 2.2.9.4 叶片相对电导率测定36
• 2.2.9.5 叶片相对含水量测定36
• 2.2.9.6 植物组织中丙二醛含量的测定36
• 2.2.9.7 植物组织中游离脯氨酸含量测定36-37
• 2.2.9.8 NBT、DAB染色和台盼蓝染色37
• 2.2.9.9 植物对病原菌的抗性分析37-38
• 3 结果与分析38-51
• 3.1 SlWHY2基因的分离和结构特征38-40
• 3.1.1 SlWHY2基因的克隆38
• 3.1.2 SlWHY2基因序列分析38-40
• 3.2 SlWHY2基因在番茄中的表达分析40-41
• 3.2.1 SlWHY2基因组织特异性表达40-41
• 3.2.2 SlWHY2基因在不同胁迫条件下的表达分析41
• 3.3 SlWHY2正义表达载体的构建41-42
• 3.4 SlWHY2基因在烟草中的遗传转化42-44
• 3.5 SlWHY2过表达提高了转基因烟草的抗旱性44-49
• 3.5.1 SlWHY2转基因烟草在干旱胁迫条件下的生长分析44-45
• 3.5.2 SlWHY2转基因烟草在干旱条件下的生理指标的变化45-46
• 3.5.3 SlWHY2转基因烟草植株积累较少的ROS46-48
• 3.5.4 SlWHY2过表达增强了转基因烟草中应激防御基因的表达48-49
• 3.6 Sl WHY2过表达增强了转基因烟草的抗病性49-51
• 4 讨论51-54
• 5 结论54-55
• 参考文献55-64
• 致谢64-65
• 硕士期间发表论文情况65

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