嗜酸性氧化亚铁硫杆菌氟抗性基因crcB的克隆及功能分析

发布时间：2017-10-19 19:11

  本文关键词：嗜酸性氧化亚铁硫杆菌氟抗性基因crcB的克隆及功能分析

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【摘要】：嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidichiobacillus Ferrooxidans)是一种重要的浸矿微生物,许多矿石中的萤石在酸性浸出环境下溶出较高浓度的氟离子,严重影响A.ferrooxidans菌的正常代谢及繁殖,从而抑制其在浸矿过程中的效率。因此,高抗氟的优良菌株可以有效提高矿石的浸出效率,对其抗氟的分子机理的研究利于人们对优良菌株进行分子改良,选育出高抗氟的优良菌株。根据已报道的嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的基因组,通过生物信息学分析发现,大多数A.ferrooxidans中也含有细菌中普遍存在的氟抗性相关基因crc B基因,已有的研究证明在部分细菌中crc B基因编码氟离子转运蛋白并和细菌的抗氟特性直接相关,但A.ferrooxidans菌中的crc B基因是否具有相同的作用需要进一步验证。我们通过分离纯化得到的两株不同的A.ferrooxidans菌株,一株抗氟,一株不抗氟,分别测定它们的抗氟能力,结果显示不抗氟菌在氟离子浓度为20mg/L的培养基中生长速率大幅弱于抗氟菌,不抗氟菌在氟离子浓度为60mg/L的培养基中完全不能生长,而抗氟菌仍能生长,但生长速率有所降低,氟抗性较差的暂定名为A.ferrooxidans BKF,具有较强的氟离子抗性的暂定名为A.ferrooxidans KF。根据A.ferrooxidans ATCC 23270全基因组序列,设计特异引物分别克隆上述两种菌株的crc B基因。通过PCR克隆获得A.ferrooxidans KF和A.ferrooxidans BKF菌中的crc B基因的全长序列。进一步进行序列比对和同源建模,获得了Crc B的理化性质及三维结构模型,结果显示A.ferrooxidans KF及A.ferrooxidans BKF菌中的Crc B蛋白之间存在三个氨基酸的差异,且其中第43、44位氨基酸的差异导致蛋白质的三维结构发生一定程度的改变,这些氨基酸的突变可能是导致其Crc B的抗氟相关功能。通过Real-time Quantitative PCR分析A.ferrooxidans KF在氟胁迫下crc B基因的转录水平上的变化,结果显示相比无氟条件下,A.ferrooxidans KF的crc B基因在含氟条件下(氟离子浓度20mg/L)转录水平上调18倍,初步证明了crc B基因与A.ferrooxidans抗氟过程密切相关。由于A.ferrooxidans菌中的crc B基因所编码的是一种逆向转运蛋白,构建表达重组质粒p ET30a-crc B,转化表达宿主感受态大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)),选取经测序验证正确后的重组菌在氟条件下诱导表达,以含空载质粒的大肠杆菌为对照,每组设三个平行,间隔两小时测OD值,结果显示含重组质粒p ET30a-crc B的重组菌在含氟培养基中的生长速度明显快于对照组,说明单基因crc B能起一定的抗氟作用。本研究利用生物信息学分析了抗氟菌株和不抗氟菌株的Crc B的氨基酸序列差异,通过模拟三维结构初步分析了突变点的差异。在转录水平上分析了抗氟菌株在氟离子下crc B基因的转录水平上的差异。在大肠杆菌中进行了异源表达,分析了crc B基因在大肠杆菌中可以起到一定的抗氟能力。后期将对两种菌株进行重测序及转录组分析,通过分析氟相关抗性基因的在转录水平上的差异,系统研究嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的抗氟的分子机理。
【关键词】：嗜酸性氧化亚铁硫杆菌 抗氟基因 基因克隆 基因表达
【学位授予单位】：东华理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 绪论10-24
• 1.1 微生物冶金现状及发展10-13
• 1.1.1 微生物冶金简介10-11
• 1.1.2 微生物冶金应用现状11-12
• 1.1.3 几种常见的浸矿微生物12-13
• 1.2 细菌抗氟研究进展13-17
• 1.2.1 氟离子细菌毒害的作用13-14
• 1.2.2 氟离子杀菌或抑菌的机制14
• 1.2.3 细菌抗氟机制14-17
• 1.2.4 细菌抗氟研究现状17
• 1.3 生物信息学分析17-18
• 1.3.1cDNA序列的分析17-18
• 1.3.2 蛋白质预测18
• 1.4 Real-time Quantitative PCR方法简介18-20
• 1.4.1 Real-time Quantitative PCR原理介绍18-20
• 1.4.2 Real-time Quantitative PCR反应条件优化方法20
• 1.5 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌研究现状20-21
• 1.5.1 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的应用21
• 1.5.2 A.ferrooxidans亚铁氧化系统21
• 1.5.3 A.ferrooxidans硫氧化系统21
• 1.6 研究的目的和意义21-23
• 1.7 实验流程图23-24
• 第二章 两株A.ferrooxidans对氟离子耐受能力的鉴别24-26
• 2.1 引言24
• 2.2 实验材料及方法24-25
• 2.2.1 实验菌株与培养基24
• 2.2.2 EDTA滴定法测定培养液中的Fe~(2+)的含量方法24-25
• 2.3 实验方法25
• 2.4 实验结果及结论25-26
• 第三章 氟抗性相关基因crcB的测序、克隆和生物信息学分析26-48
• 3.1 引言26
• 3.2 实验材料26-27
• 3.2.1 菌种与质粒26
• 3.2.2 主要试剂26
• 3.2.3 主要仪器26
• 3.2.4 培养基26-27
• 3.3 实验方法27-31
• 3.3.1 A.ferrooxidans菌基因组提取27
• 3.3.2 crcB基因测序27-30
• 3.3.3 crcB基因的克隆30
• 3.3.4 crcB基因生物信息学分析30-31
• 3.4 结果分析31-46
• 3.4.1 crcB基因的克隆31
• 3.4.2 crcB基因测序结果对比分析31-35
• 3.4.3 crcB基因生物信息学分析35-46
• 3.5 讨论46-48
• 第四章 不同氟条件下A.ferrooxidans KF的crcB基因差异表达48-60
• 4.1 引言48
• 4.2 实验材料48
• 4.2.1 实验菌株及试剂48
• 4.2.2 实验仪器48
• 4.2.3 培养基及缓冲液48
• 4.3 实验方法48-53
• 4.3.1 原菌株总RNA提取48-49
• 4.3.2 总RNA反转录成cDNA49
• 4.3.3 两个样本crcB基因表达量差异测定49-53
• 4.3.4 Real-time Quantitative PCR数据处理53
• 4.4 结果分析53-59
• 4.4.1 RNA验证53-54
• 4.4.2 确定反应退火温度54-55
• 4.4.3 目的基因及内参基因的标准曲线和熔解曲线55-59
• 4.4.4 氟离子刺激下A.ferrooxidans KF的crcB基因的差异性表达59
• 4.5 讨论59-60
• 第五章 crcB基因在大肠杆菌中的诱导表达60-66
• 5.1 引言60
• 5.2 实验菌种、试剂及仪器60
• 5.2.1 实验菌种60
• 5.2.2 实验试剂60
• 5.2.3 实验仪器60
• 5.2.4 培养基及缓冲液60
• 5.3 实验方法60-63
• 5.3.1 构建重组表达质粒载体pET30a-crcB及导入表达宿主E.coli BL21DE360-63
• 5.3.2 重组菌抗氟能力检测63
• 5.4 结果分析63-65
• 5.4.1 构建重组表达载体pET30a-crcB63-65
• 5.4.2 重组菌（BL21DE3）抗氟能力检测65
• 5.5 讨论65-66
• 结论66-68
• 参考文献68-74
• 致谢74-75
• 攻读硕士期间发表的论文75

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