银杏MYB家族基因的克隆及表达分析

发布时间：2017-10-20 01:24

  本文关键词：银杏MYB家族基因的克隆及表达分析

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【摘要】：MYB基因是植物转录因子中超大基因家族之一,已被证实广泛参与植物体的次生代谢调节、生物及非生物环境胁迫应答,对植物生长发育及花、叶等器官的形态建成有重要的调控作用。银杏是我国特有的珍贵树种,银杏叶黄酮有着许多独特的中药药理作用,尤其是在心脑血管疾病治疗中有显著的疗效,而很多MYB基因对植物的黄酮代谢具有重要的调控作用。因此,本文以银杏作为实验材料,从中克隆了新的MYB基因,并初步探索了MYB基因在银杏黄酮生物合成及其环境胁迫应答中的调控作用。主要研究结果如下:1结合植物中MYB基因DNA结合域的保守区,利用Primer Premier 5.0设计特异性引物,采用RT-PCR和RACE技术,从银杏中克隆出GbMYB1、GbMYB2和GbMYB3 3条新的MYB基因,其中GbMYB1全长1101 bp,包括249个氨基酸的开放阅读框(OFR),其中OFR为750 bp;GbMYB2全长1278 bp,包括389个氨基酸的开放阅读框(OFR),其中OFR为1170 bp;GbMYB3全长1442 bp,包括417个氨基酸的开放阅读框(OFR),其中OFR为1254 bp。利用MEGA 5.0、DNAMAN等软件构建MYB系统发育树,分析发现GbMYB1和GbMYB2与蓖麻的RcMYB在进化上最相近,GbMYB3与裸子植物云杉的PtMYB在进化上最相近。通过氨基酸序列比对,发现这3条基因均具有两个MYB结构域,属于典型的R2R3-MYB基因。2以两年生银杏扦插苗为实验材料,分别进行了盐(NaCl)、脱落酸(ABA)和低温(4℃)三种非生物胁迫处理。通过实时荧光定量PCR,检测了三个GbMYB基因在不同环境胁迫处理下不同时间的表达特异性。结果显示,当银杏受到非生物胁迫时,GbMYB基因在银杏体内表达明显上调。而通过测量不同环境胁迫处理的不同时期的银杏叶片总黄酮的含量,发现当银杏受到非生物胁迫时,银杏体内黄酮类化合物有一定的积累。由此,我们推测GbMYB基因可能参与银杏黄酮代谢的调控。3利用gateway技术构建GbMYB基因的过表达载体,并将克隆出的GbMYB1、GbMYB2和GbMYB3基因转入拟南芥中,进行基因的表达分析。结果表明,GbMYB基因的过表达影响植物的生长发育,转基因的植株高明显优于野生型和空质粒对照。对转基因拟南芥进行氯化钠(NaCl)、脱落酸(ABA)和低温(4℃)非生物胁迫处理,发现GbMYB1、GbMYB2和GbMYB3基因在拟南芥中表达,增强了拟南芥对氯化钠(NaCl)高盐非生物胁迫的耐性。
【关键词】：银杏 MYB转录因子 非生物胁迫 银杏黄酮 基因表达调控
【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S792.95
【目录】：

• 致谢3-4
• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 文献综述10-19
• 1.1 银杏简介10
• 1.1.1 银杏概述10
• 1.1.2 银杏基因工程应用研究10
• 1.2 银杏黄酮类化合物10-14
• 1.2.1 银杏叶黄酮类化合物成分10-11
• 1.2.2 银杏黄酮类化合物的作用11
• 1.2.3 银杏黄酮类化合物生物合成代谢途径11-13
• 1.2.4 环境因素对银杏黄酮合成的影响13-14
• 1.3 植物MYB转录因子研究14-17
• 1.3.1 植物MYB转录因子的特征与分类14-15
• 1.3.2 植物MYB转录因子的起源与进化15
• 1.3.3 植物MYB转录因子的功能15-17
• 1.4 目的与意义17-18
• 1.5 本课题研究的主要内容及目标18-19
• 1.5.1 研究目标18
• 1.5.2 研究内容18-19
• 第二章 银杏MYB转录因子基因的克隆19-35
• 2.1 试验材料19-20
• 2.1.1 植物材料19
• 2.1.2 菌种19
• 2.1.3 载体19
• 2.1.4 酶与试剂19
• 2.1.5 其他试剂19
• 2.1.6 溶液19
• 2.1.7 培养基19-20
• 2.1.8 主要仪器20
• 2.2 试验方法20-29
• 2.2.1 银杏叶总RNA的提取20-21
• 2.2.2 总RNA的检测及纯化21
• 2.2.3 cDNA的合成21-22
• 2.2.4 银杏MYB基因两端序列的扩增22-23
• 2.2.5 银杏MYB基因的 3' RACE克隆23-24
• 2.2.6 银杏MYB基因的 5' RACE克隆24-26
• 2.2.7 目的片段的凝胶回收和纯化26
• 2.2.8 目的片段与克隆载体的连接26-27
• 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化27
• 2.2.10 阳性克隆菌株的筛选27-28
• 2.2.11 银杏MYB基因全长cDNA的扩增28-29
• 2.3 试验结果29-33
• 2.3.1 银杏叶总RNA的提取29
• 2.3.2 MYB基因的克隆29-30
• 2.3.3 银杏叶MYB基因全长cDNA全长序列的获得30
• 2.3.4 银杏叶MYB基因全长cDNA序列30
• 2.3.5 银杏MYB基因的OFR分析30-31
• 2.3.6 银杏MYB基因的BLAST比对分析31-32
• 2.3.7 银杏MYB基因氨基酸序列的分析32-33
• 2.3.8 银杏MYB基因的进化树分析33
• 2.4 结果讨论33-35
• 第三章 不同环境条件下银杏MYB基因定量表达分析35-40
• 3.1 实验材料与设备35
• 3.1.1 植物材料及其处理35
• 3.1.2 实验试剂35
• 3.1.3 仪器35
• 3.2 试验方法35-37
• 3.2.1 RNA提取、纯化及cDNA的合成35
• 3.2.2 实时荧光定量PCR引物设计35-36
• 3.2.3 实时定量RT-PCR36
• 3.2.4 银杏叶总黄酮的的提取36
• 3.2.5 银杏叶总黄酮的的测定36-37
• 3.3 结果与分析37-39
• 3.3.1 内参基因GAPDH的筛选37
• 3.3.2 银杏MYB基因在不同环境胁迫处理的表达分析37-38
• 3.3.3 银杏不同胁迫处理后总黄酮的检测38-39
• 3.4 讨论39-40
• 第四章 银杏MYB基因的表达载体构建及遗传转化40-48
• 4.1 试验材料40
• 4.1.1 植物材料40
• 4.1.2 菌株及载体40
• 4.2 试验方法40-46
• 4.2.1 银杏MYB基因gateway表达载体的构建40-44
• 4.2.2 农杆菌介导的遗传转化44-45
• 4.2.3 转基因拟南芥植株的阳性筛选45-46
• 4.3 结果分析46-47
• 4.3.1 银杏MYB基因与TOPO载体入门克隆阳性重组子检测46
• 4.3.2 银杏MYB基因表达载体阳性重组子检测46
• 4.3.3 转基因拟南芥的初步检测46-47
• 4.4 讨论47-48
• 第五章 GBMYB1、GBMYB2和GBMYB3基因在拟南芥中的表达及相关功能分析48-52
• 5.1 实验材料48
• 5.2 试验方法48-49
• 5.2.1 T3代纯合转基因拟南芥植株的获得48
• 5.2.2 转基因植株表型的观察48-49
• 5.3 结果与分析49-51
• 5.3.1 T3代转基因纯合植株株高表型的观察49-50
• 5.3.2 转基因拟南芥对非生物胁迫的抗性分析50-51
• 5.4 结果分析51-52
• 第六章 结论与展望52-54
• 6.1 主要结论52
• 6.2 展望52-54
• 参考文献54-58
• 附表58-61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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3 朱灿灿;田亚玲;曹福亮;汪贵斌;;干旱胁迫对银杏叶类黄酮年动态变化的影响[J];林业科技开发;2010年04期

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本文编号：1064470