黄瓜“mango”突变体分析与基因功能研究

发布时间：2017-10-20 07:24

  本文关键词：黄瓜“mango”突变体分析与基因功能研究

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【摘要】：黄瓜花性型分化多样,已成为研究植物性型分化的模式植物。花器官发育的调控研究由来已久,调控关键因子的挖掘也是研究的主要内容。黄瓜“mango”突变体由于其雌、雄花发育异常,成为进一步研究花器官发育调控的重要材料。主要研究结果如下:1.对突变体及野生型植株各部位形态观察发现,与野生型黄瓜相比,“mango”突变体幼苗期子叶皱缩不平展;第一、二片真叶楔形且不平展,从第三片真叶开始,主叶脉伸出;雌、雄花花瓣均变窄,雄蕊花药组织退化,不能产生花粉,表现为雄性不育;雌蕊子房细长,柱头部分融合,温室栽培环境下不能授粉、结实;开放的环境下可以授粉、结实,但结实率极低,果实外形似芒果,因此得名“mango”突变。对叶片及不同发育时期雌花、雄花进行组织切片观察发现,突变体叶片栅栏组织、维管组织排列不规律,叶片表皮细胞不平滑,单位面积细胞数目减少;雄花发育过程中,花药室及花粉发育受到抑制;雌花发育过程中,胚珠发育异常,子房膨大受到限制。2.前期工作中对突变体候选基因进行了图位克隆,并将候选基因最终定位于第1染色体长臂约16.7kb区间内,对该区间内候选基因进行预测分析后发现只有一个功能基因为Csa1M042780,基因编码WUSCHEL-related homeobox1蛋白,与拟南芥中AtWOX1基因同源,将该基因命名为CsWOX1。进一步分析表明该基因属于WOX转录因子家族成员,突变产生的原因是该基因第四号外显子缺失一个核苷酸,造成移码突变,翻译提前终止,使得编码蛋白短截且丢失WUS-box保守序列。随后在野生型及突变体材料顶芽、雌花、雄花、叶片、根等组织进行CsWOX1/Cswox1基因特异性表达分析后发现,突变后Cswox1基因表达量显著升高。由此推测,突变体的产生可能是CsWOX1蛋白结构改变或是其突变后基因上调表达引起。3.为进一步探明突变体产生的原因,将CsWOX1/Cswox1基因分别置于35S过表达启动子下进行拟南芥遗传转化,对阳性转基因植株进行表型分析后发现,CsWOX1及Cswox1过表达对拟南芥花器官的形态及植株育性有一定影响,但两个转基因系的阳性株在表型上无明显差异,进一步说明在过表达情况下CsWOX1与Cswox1基因功能无差异。由此可推知,黄瓜“mango”突变表型的产生可能是Cswox1基因上调表达引起,虽然WUS-box保守序列缺失,但蛋白结构的改变可能不是植株突变的主要因素。4.在突变体与野生型材料四叶一心时期取顶芽进行RNA-seq分析,结果表明,差异基因的转录组分类分析中,WOX转录因子家族基因只有WOX1及WUS基因,由此可知黄瓜WUS与WOX1基因对雄花发育调控非常重要。结合拟南芥WUS相关基因及调控机制,进一步分析RNA-Seq数据,发现黄瓜雄花发育中也可能存在与拟南芥WUS基因相似的调控通路,黄瓜中主要包括的基因有:CsWUS,CsAG,CsSPL/CsNZZ,CsMYB33,CsDYT1,Cs AMS,CsMYB103,CsMS1,这些同源基因的表达模式与拟南芥相似。对黄瓜子房发育中CsWOX1,CsWUS,CsAG,CsSPL/CsNZZ进行表达分析后发现,突变体中Cswox1基因表达上调后CsWUS,CsAG,CsSPL/CsNZZ基因表达严重下调,与雄花中相应基因表达模式一致。由此可知,在黄瓜花器官发育进程中,WUS基因参与的调控通路与拟南芥相似,但在拟南芥中AtWOX1与At WUS基因之间尚且没有明确的调控关系研究,而从RNA-seq分析后发现,黄瓜wox1可以抑制WUS基因的表达。综上结果,“mango”突变表型的产生可能是由Cswox1基因表达上调后抑制CsWUS及其相关基因的表达引起。
【关键词】：黄瓜 “mango”突变体 CsWOX1 CsWUS 花发育
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S642.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文献综述12-20
• 1.1 研究背景12-14
• 1.1.1 黄瓜的生物学特性12
• 1.1.2 黄瓜突变体研究进展12-14
• 1.1.2.1 黄瓜突变体的获得12-13
• 1.1.2.2 黄瓜突变体的主要类型13-14
• 1.2 “mango”突变体候选基因的图位克隆14-15
• 1.2.1 “mango”突变体的来源及表型特征14-15
• 1.2.2 “mango”突变体基因的图位克隆15
• 1.3 WOX转录因子家族研究进展15-19
• 1.3.1 WOX转录因子结构特点15-16
• 1.3.2 WOX转录因子研究进展16-19
• 1.4 本研究的目的意义和主要内容19-20
• 1.4.1 本研究的目的和意义19
• 1.4.2 本研究的主要内容19-20
• 第二章 黄瓜CsWOX1基因的克隆及功能分析20-42
• 2.1 材料与方法20-25
• 2.1.1 试验材料20-21
• 2.1.1.1 植物材料20
• 2.1.1.2 质粒和菌株20
• 2.1.1.3 主要试剂与仪器20
• 2.1.1.4 引物20-21
• 2.1.2 试验方法21-25
• 2.1.2.1 黄瓜AM218野生型与突变体植株表型观察与分析21-22
• 2.1.2.2 CsWOX1基因相关生物信息学分析22-23
• 2.1.2.3 CsWOX1、Cswox1基因在不同组织的表达分析23
• 2.1.2.4 CsWOX1、Cswox1原核表达分析23-25
• 2.1.2.5 CsWOX1、Cswox1目标蛋白的亚细胞定位分析25
• 2.2 数据处理25
• 2.3 结果与分析25-40
• 2.3.1 野生型与突变体材组织观察分析25-31
• 2.3.1.1 突变体与野生型植物学特性观察与分析26-28
• 2.3.1.2 突变体与野生型叶片组织结构观察与分析28-29
• 2.3.1.3 雌、雄花芽不同发育时期的石蜡切片观察29-31
• 2.3.2 CsWOX1基因相关生物信息学分析31-36
• 2.3.2.1 CsWOX1与拟南芥WOX蛋白家族序列比对31-33
• 2.3.2.2 黄瓜CsWOX1基因突变位点分析33
• 2.3.2.3 CsWOX1蛋白理化性质及氨基酸序列分析33-34
• 2.3.2.4 CsWOX1、Cswox1亚细胞定位分析及蛋白质功能分类34-36
• 2.3.3 CsWOX1、Cswox1基因在野生型及突变体植株的表达分析36-37
• 2.3.4 CsWOX1、Cswox1基因编码蛋白的原核表达分析37-38
• 2.3.4.1 重组质粒的酶切鉴定37
• 2.3.4.2 CsWOX1、Cswox1原核表达及分析37-38
• 2.3.5 CsWOX1、Cswox1目标蛋白的亚细胞定位分析38-40
• 2.3.5.1 P_(35S):: CsWOX1-GFP、P_(35S):: Cswox1-GFP重组载体的鉴定38-39
• 2.3.5.2 报告基因GFP在洋葱表皮细胞中的分布39-40
• 2.4 讨论40-42
• 第三章 黄瓜转录因子CsWOX1在拟南芥发育中的功能研究42-50
• 3.1 材料与方法42-44
• 3.1.1 材料42-43
• 3.1.1.1 植物材料42
• 3.1.1.2 质粒和菌株42
• 3.1.1.3 试验相关引物42-43
• 3.1.2 试验方法43-44
• 3.1.2.1 黄瓜CsWOX1、Cswox1基因CDS序列克隆43
• 3.1.2.2 P_(35s):: CsWOX1-GUS、P_(35s):: Cswox1-GUS融合载体的构建43
• 3.1.2.3 黄瓜CsWOX1、Cswox1基因在拟南芥中的过表达43
• 3.1.2.4 转基因拟南芥植株表型观察与分析43-44
• 3.2 结果与分析44-48
• 3.2.1 转基因拟南芥表型观察与分析44-48
• 3.2.1.1 转基因拟南芥植株表型观察44-46
• 3.2.1.2 M31、W44 转基因拟南芥花粉畸形率测定46-47
• 3.2.1.3 转基因拟南芥平均果荚长度及种子量统计分析47-48
• 3.3 讨论48-50
• 第四章 黄瓜野生型及突变体转录组测序分析50-59
• 4.1 材料与方法50-52
• 4.1.1 材料50
• 4.1.2 试验方法50
• 4.1.2.1 RNA-Seq测序及分析50
• 4.1.2.2 子房发育相关基因表达分析50
• 4.1.3 试验相关引物50-52
• 4.2 结果与分析52-58
• 4.2.1 测序结果52-57
• 4.2.1.1 RNA测序质量评估52
• 4.2.1.2 转录组数据结果简况52-53
• 4.2.1.3 RNA-seq差异基因的qPCR验证53-54
• 4.2.1.4 差异基因的GO富集分析54-55
• 4.2.1.5 差异基因的KEGG分析55-56
• 4.2.1.6 差异基因中转录因子家族分析56-57
• 4.2.2 野生型与突变体子房发育WUS相关基因表达分析57-58
• 4.3 讨论58-59
• 结论59-60
• 参考文献60-64
• 附录64-69
• 致谢69-70
• 作者简介70

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