柠条锦鸡儿海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因的克隆及特性分析

发布时间：2017-10-20 08:06

  本文关键词：柠条锦鸡儿海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因的克隆及特性分析

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【摘要】：柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii Kom.)主要分布在内蒙古西部地区,是一种优良的防风固沙和水土保持植物,也是荒漠、荒漠草原地带的优良灌木饲料,具有广泛的适应性和较强的抗逆性。海藻糖是一种非还原性二糖,在调节植物对逆境的适应性中发挥重要作用。在非生物胁迫条件下,海藻糖作为一种渗透调节物质保护植物免受伤害。海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase, TPP)是海藻糖代谢途径中的关键酶,它催化海藻糖-6-磷酸去磷酸化进而生成海藻糖。Tpp基因的表达会直接影响海藻糖的合成,因此研究柠条锦鸡儿Tpp基因的功能特性具有重要意义。本研究利用同源克隆技术分离了柠条锦鸡儿的海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因(CkTpp) cDNA序列1004bp,其包含一个855bp的开放阅读框,编码284个氨基酸。, CkTpp编码的蛋白质分子量为32.3KdDa,理论等电点为9.2。系统进化分析表明CkTpp与黑豆、野大豆、鹰嘴豆等豆科植物TPP的亲缘关系较近。为了研究CkTpp基因的异源表达特性,构建了pET-32a(+)-CkTpp原核表达载体,并对原核表达菌株Transsetta进行了非生物胁迫下的表型分析,其结果显示CkTpp基因的表达使转基因菌株的抗旱、耐热和耐盐性增强。同时,用同源重组法构建了pBI101-CkTpp双元表达载体,进而为通过转化拟南芥进行基因功能分析奠定了基础。
【关键词】：柠条锦鸡儿 海藻糖 海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶 表达载体
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S793.3
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 引言11-15
• 1.1 研究背景11-14
• 1.1.1 柠条锦鸡儿11
• 1.1.2 海藻糖合成途径11-12
• 1.1.3 海藻糖研究进展12
• 1.1.4 海藻糖与植物的开花12
• 1.1.5 海藻糖与致病菌的毒素合成12-13
• 1.1.6 海藻糖与抗性生理13
• 1.1.7 海藻糖合成途径中关键酶基因的过量表达导致的生长畸变13-14
• 1.2 研究意义14
• 1.3 技术路线14-15
• 第二章 实验材料及方法15-32
• 2.1 实验材料15-17
• 2.1.1 研究材料15
• 2.1.2 试剂及其配制方法15-17
• 2.1.3 主要实验仪器17
• 2.2 CkTpp基因的克隆及生物信息学分析17-24
• 2.2.1 CkTpp基因的克隆17-23
• 2.2.2 CkTpp基因的序列分析23-24
• 2.3 CkTpp在原核生物Transsetta中的异源表达分析24-28
• 2.3.1 原核表达载体pET-32a(+)-CkTpp的构建24-27
• 2.3.2 原核表达菌的遗传转化27
• 2.3.3 原核表达菌中CkTpp蛋白的诱导27-28
• 2.3.4 转基因菌株对非生物胁迫的耐受性检测28
• 2.4 真核表达载体pBI101-CkTpp的构建28-32
• 2.4.1 pBI101-CkTpp表达载体构建策略28-29
• 2.4.2 构建pBI101-CkTpp重组载体用引物设计29
• 2.4.3 目的片段CkTpp的制备29-30
• 2.4.4 载体pBI101和目的片段CkTpp的同源重组及转化和鉴定30-32
• 第三章 实验结果32-46
• 3.1 CkTpp基因中间片段的克隆32
• 3.2 CkTpp基因末端序列的克隆32-33
• 3.2.1 CkTpp基因5’末端的克隆32-33
• 3.2.2 CkTpp基因3’末端的克隆33
• 3.3 CkTpp cDNA的全长克隆33-34
• 3.4 CkTpp基因组DNA的全长克隆34-35
• 3.4.1 柠条锦鸡儿基因组DNA的提取34
• 3.4.2 CkTpp基因组DNA的全长克隆34-35
• 3.5 CkTpp基因序列的生物信息学分析35-38
• 3.5.1 CkTpp基因的序列分析35-36
• 3.5.2 CkTpp亚细胞定位预测36
• 3.5.3 CkTpp亲疏水性预测36
• 3.5.4 CkTpp二级结构预测36-37
• 3.5.5 CkTpp保守结构域分析37
• 3.5.6 CkTpp跨膜结构域预测37
• 3.5.7 CkTpp系统进化分析37-38
• 3.6 原核表达载体pET-32a(+)-CkTpp的构建38-41
• 3.6.1 CkTpp基因开放阅读框的扩增38-39
• 3.6.2 质粒pMD19-T-CkTpp和pET-32a(+)酶切39-40
• 3.6.3 重组质粒pET-32a(+)-CkTpp的鉴定40-41
• 3.7 融合蛋白在大肠杆菌Transsetta中的诱导表达41
• 3.8 转基因苗株的抗逆性检测41-43
• 3.9 真核表达载体pBI101-CkTpp的构建43-46
• 3.9.1 目的片段CkTpp的扩增43-44
• 3.9.2 载体pBI101的线性化44
• 3.9.3 重组质粒pBI101-CkTpp鉴定44-46
• 第四章 讨论和结论46-49
• 4.1 讨论46-47
• 4.2 结论47-49
• 参考文献49-55
• 致谢55

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本文编号：1066162