葫芦科栝楼属植物鲨烯合酶SS基因克隆及原核表达

发布时间：2017-10-21 00:05

  本文关键词：葫芦科栝楼属植物鲨烯合酶SS基因克隆及原核表达

  更多相关文章： 截叶栝楼 栝楼 红花栝楼 鲨烯合酶 基因克隆 序列分析 原核表达分析

【摘要】：鲨烯合酶(squalene synthase, SS, EC2.5.1.21)是植物甾醇和三萜皂苷生物合成通路过程中的一个关键酶,催化着两分子的法呢酯焦磷酸(FPP)缩合生成鲨烯(SQ),而鲨烯则在2,3-氧化鲨烯环化酶催化下,生成三萜、甾醇、胆固醇等重要的植物次生代谢产物。鲨烯合酶SS在鲨烯后续生物合成通路中处于关键地位,其含量和活性决定了后续产物的合成。因而,近年来人们对鲨烯合酶的研究倍受重视。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)及末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)法,首次分离得到截叶栝楼、栝楼鲨烯合酶SS基因全长cDNA序列,同时对截叶栝楼、栝楼、红花栝楼SS基因进行了原核表达及生物信息学分析,并对推衍的蛋白质性质特征进行了比较,为葫芦科栝楼属植物三萜合成通路中关键酶SS的研究奠定了基础。本论文的主要研究结果如下：1、SS基因克隆：(1)采用RACE及TdT酶法获得截叶栝楼的两个全长cDNA克隆。其cDNA序列全长分别为1983 bp和1902 bp,差异位于编码区外的3'UTR,包含一个1254 bp的开放阅读框序列,编码417个氨基酸残基,相对分子量为47.6 kD。(2)采用3'RACE及5'RACE的方法,克隆得到栝楼SS基因cDNA序列,序列长度为1522 bp,其中包括1254 bp的开放读码框序列,编码417个氨基酸残基,分子量大小约为47.6 kD。2、SS基因序列分析：通过NCBI的Blast比对,发现截叶栝楼SS基因的核苷酸序列与已知植物SS核苷酸序列的同源性为78%～91%,氨基酸序列同源性为79%～94%；栝楼SS基因的核苷酸序列与已知植物SS核苷酸序列的同源性为78%～93%,氨基酸序列同源性为79%～95%。通过构建系统发育树分析,发现截叶栝楼、栝楼SS与罗汉果、绞股蓝、红花栝楼、木鳖子的SS亲缘关系最近,与植物分类学上的植物亲缘关系一致。我们克隆得到的截叶栝楼、栝楼SS的cDNA序列,与葫芦科植物鲨烯合酶基因的同源性最高,与预测结果相符合。3、原核表达分析：分别将截叶栝楼、红花栝楼、栝楼鲨烯合酶基因的编码序列插入到原核表达载体pET32a(+)中,构建的重组原核表达载体pET32a(+)-SS,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导后经SDS-PAGE蛋白电泳检测,电泳结果表明重组体成功地在BL21(DE3)中表达出约66kD的融合蛋白,其中pET32a(+)表达标签大小约为18 kD。本研究成功克隆得到截叶括楼和栝楼鲨烯合酶SS基因的全长cDNA序列,并对截叶栝楼、红花栝楼及栝楼鲨烯合酶进行了原核表达分析,为进一步研究葫芦科植物三萜合成通路中关键酶SS的正选择位点及功能的关联性分析奠定基础。为深入了解葫芦科栝楼属植物三萜皂苷生物合成途径及其调控的分子机制,明确三萜皂苷合成途径中关键酶的结构特征及其功能,从而在分子水平上实现三萜皂苷生物合成的人工调控,提高其有效成分三萜皂苷的生物合成量,具有重要的意义。
【关键词】：截叶栝楼 栝楼 红花栝楼 鲨烯合酶 基因克隆 序列分析 原核表达分析
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 个人简历3-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 前言12-14
• 第一部分 栝楼属植物鲨烯合酶(SS)基因克隆及序列分析14-51
• 一、截叶栝楼鲨烯合酶SS基因全长cDNA序列克隆14-29
• 1. 材料与仪器14-16
• 1.1 植物材料14
• 1.2 实验仪器14
• 1.3 主要试剂14-15
• 1.4 溶液配制15
• 1.5 RNA酶处理15-16
• 2. 方法16-29
• 2.1 截叶栝楼总RNA的提取及电泳检测16-17
• 2.2 截叶栝楼SS基因3'RACE扩增17-23
• 2.3 截叶栝楼SS基因5'RACE扩增23-28
• 2.4 截叶栝楼SS基因全长cDNA拼接及生物信息学分析28-29
• 二、栝楼鲨烯合酶SS基因cDNA克隆29-35
• 1 材料与仪器29
• 2 方法29-35
• 2.1 栝楼总RNA的提取及电泳检测29
• 2.2 栝楼SS基因3'RACE扩增29-32
• 2.3 栝楼SS基因5'RACE扩增32-34
• 2.4 栝楼SS基因cDNA拼接及生物信息学分析34-35
• 三、结果与分析35-51
• 1.1 植物总RNA电泳检测35
• 1.2 3'RACE及5'RACE扩增电泳结果35-36
• 1.3 菌落PCR鉴定阳性克隆36-38
• 1.4 栝楼属植物鲨烯合酶SS基因生物信息学分析38-51
• 第二部分 栝楼属植物鲨烯合酶SS基因的原核表达51-64
• 1 材料与仪器51-53
• 1.1 实验材料51
• 1.2 实验仪器51
• 1.3 溶液配制51-53
• 2 方法53-59
• 2.1 目的片段SS与pET32a(+)原核表达载体构建重组体53-58
• 2.2 重组质粒pET32a(+)-SS诱导表达及SDS-PAGE电泳鉴定58
• 2.3 诱导表达蛋白SDS-PAGE电泳鉴定58-59
• 3 结果与分析59-61
• 3.1 栝楼属植物SS基因ORF扩增59
• 3.2 栝楼属植物SS基因原核表达SDS-PAGE电泳结果59-61
• 4 讨论61-64
• 小结64-65
• 参考文献65-69
• 综述69-83
• 参考文献78-83
• 致谢83-84
• 攻读学位期间发表的学术论文84

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本文编号：1070122