巴西橡胶树HbJAZs基因的克隆与互作蛋白鉴定

发布时间：2017-10-21 04:39

  本文关键词：巴西橡胶树HbJAZs基因的克隆与互作蛋白鉴定

  更多相关文章： 橡胶树 茉莉酸 基因克隆 荧光定量PCR HbJAZs酵母双杂互作

【摘要】：巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是天然橡胶的主要来源。胶乳的产生和贮存主要通过乳管来进行,对橡胶树进行机械损伤或外施茉莉酸都可以诱导乳管分化。茉莉酸是调控橡胶树乳管分化重要的信号分子,而JAZ蛋白是茉莉酸信号途径下游基因转录调控关键的抑制因子,因此对JAZ蛋白的研究对于研究橡胶树的乳管分化以及产胶机理有重大意义。本研究从以下几个方面对橡胶树JAZ蛋白进行了研究：(1) 通过结合GenBank中已有的橡胶cDNA序列和本实验室转录组测序数据,通过电子克隆的方法获得5个橡胶JAZ基因全长序列,并通过PCR技术成功扩增得到HbJAZ3, HbJAZ5, HbJAZ6和HbJAZ12。其编码区大小分别为852bp,786bp, 426bp和699bp。(2)利用实时定量PCR研究了HbJAZ3, HbJAZ5, HbJAZ6, HbJAZ12这四个基因在胶乳、叶片、茎尖、树皮、雄蕊及雌蕊中的表达组织特异性,以及伤诱导、外施茉莉酸处理对这四个基因表达的影响。发现HbJAZ3在雌蕊和雄蕊中表达量较高,HbJAZ5在树皮中表达量最高,HbJAZ6在树皮和雄蕊中表达量高,HbJAZ12在雌蕊中表达量最高。说明这四种基因可能分别在这些组织中起重要作用。另外发现伤诱导均可以诱导这四种基因的表达。而茉莉酸处理可以诱导HbJAZ3和HbJAZ12的表达,抑制HbJAZ4和HbJAZ6的表达。(3)构建HbJAZ3,5,6,12的酵母双杂诱饵以及捕获载体,再加上已有的其余HbJAZs的酵母诱饵与捕获载体,进行HbJAZs蛋白之间的互作,发现HbJAZ2,5,6能够形成同源二聚体互作,而HbJAZ1,2,3,5,6,8,9,10,11,12能够与某个或几个其余HbJAZ蛋白形成异源二聚体进而互作。(4)将已有的所有HbJAZs的捕获载体与实验室已有的HbCoil的诱饵载体进行酵母双杂互作,发现在添加冠菌素(Coronatine)的情况下,HbCoi1与HbJAZs中的HbJAZ8, HbJAZ9互作,而不与其余的HbJAZs互作,说明在橡胶树中,HbCoi1可能通过与HbJAZs蛋白互作调控下游信号。
【关键词】：橡胶树 茉莉酸 基因克隆 荧光定量PCR HbJAZs酵母双杂互作
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S794.1
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 1 引言8-17
• 1.1 研究背景8
• 1.2 巴西橡胶树简介以及橡胶树乳管分化机制和胶乳产生途径8-10
• 1.2.1 巴西橡胶树简介8
• 1.2.2 橡胶树乳管分化的研究8-9
• 1.2.3 巴西橡胶树胶乳的生物合成9-10
• 1.3 植物茉莉酸信号途径概述10-15
• 1.3.1 茉莉酸及其衍生物简介10
• 1.3.2 茉莉酸的生物合成10-11
• 1.3.3 茉莉酸的信号传导途径11-12
• 1.3.4 JAZ基因家族12-13
• 1.3.5 茉莉酸信号的受体13-14
• 1.3.6 茉莉酸在橡胶生物合成中的作用14-15
• 1.4 酵母双杂技术15-16
• 1.4.1 酵母双杂技术15
• 1.4.2 酵母双杂技术原理15-16
• 1.4.3 酵母双杂系统的构建16
• 1.5 本研究的目的和意义16
• 1.6 本研究技术路线16-17
• 2 材料与方法17-31
• 2.1 材料与试剂17
• 2.1.1 实验材料17
• 2.1.2 试剂及工具17
• 2.2 实验方法17-31
• 2.2.1 巴西橡胶HbJAZs基因的cDNA全长克隆17-21
• 2.2.2 巴西橡胶HbJAZs基因荧光定量表达21-24
• 2.2.3 HbJAZs酵母双杂载体构建以及与HbCoil1蛋白和橡胶JAZ家族酵母双杂互作24-31
• 3 结果与分析31-46
• 3.1 HbJAZ3,5,6,12的cDNA克隆以及分析31-35
• 3.1.1 HbJAZ3,5,6,12的cDNA克隆31
• 3.1.2 橡胶基因HbJAZ3,5,6,12的生物信息学分析31-34
• 3.1.3 HbJAZ3,5,6,12同源性以及蛋白序列分析34-35
• 3.2 HbJAZs荧光定量PCR分析35-39
• 3.2.1 橡胶树叶片RNA提取35-36
• 3.2.2 荧光定量PCR36-39
• 3.3 HbJAZs之间的蛋白互作验证39-43
• 3.3.1 构建HbJAZ3,5,6,12的诱饵以及捕获载体39
• 3.3.2 酵母感受态的高效转化39-40
• 3.3.3 酵母双杂转化40-43
• 3.4 HbJAZs与HbCoi1的蛋白互作验证43-46
• 3.4.1 HbJAZs的诱饵载体以及HbCoi1的捕获载体的构建43
• 3.4.2 酵母感受态的转化43-44
• 3.4.3 酵母双杂转化44-46
• 4 讨论46-49
• 4.1 HbJAZ3,5,6,12基因的克隆以及生物信息学分析46-47
• 4.2 HbJAZ3,5,6,12在橡胶树中的表达分析47
• 4.3 HbJAZ蛋白之间的互作47-48
• 4.4 HbCoi1与HbJAZ蛋白之间的互作48-49
• 参考文献49-52
• 附录52-55
• 致谢55

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