日本沼虾微卫星标记开发与遗传构造解析及性别相关遗传标记筛选研讨

发布时间：2014-12-23 10:51

 

【摘要】 日本沼虾隶属十足目、长臂虾科、沼虾属，自然分布于中国、日本、越南及俄罗斯远东地区，在我国各地淡水水域中都有分布。日本沼虾的养殖始于二十世纪五十年代，从2004年起，我国日本沼虾的年养殖产量就超过了20万吨。多年来，日本沼虾在市场上一直供不应求，畅销不衰，是一种养殖效益非常可观的淡水虾类。但长期以来，繁殖日本沼虾用的亲本多为野生个体，未经过系统选育，日本沼虾的养殖单产较低，且多是套养在各种鱼类的养殖池塘中，主养日本沼虾的池塘较少。因此开展日本沼虾的种质资源保护、良种选育工作是当前日本沼虾养殖业中亟待解决的问题。由于当前已知的日本沼虾微卫星标记只有二十多个，这严重地限制了日本沼虾的群体遗传结构分析、种质资源评价等工作；此外，日本沼虾雄性生长速度显著大于雌性，开展单性苗种培育意义重大，但当前没有鉴别日本沼虾遗传性别的分子标记，使得单性苗种培育工作一直无法得以开展。本论文的研究内容主要包含如下3个方面：1.日本沼虾多态性微卫星标记的开发：（1）FIASCO法开发微卫星标记。通过生物素标记的探针（GT）13和（GA）13富集微卫星序列，共获得含微卫星的序列334个，成功设计引物110对，设计引物的序列含有的微卫星重复多为2碱基重复，重复数多数在10次以上。设计的引物扩增的目的条带大小在95-356bp之间。多态性分析显示，24对引物扩增出的条带为清晰稳定的多态，开发效率（多态性引物占总设计引物的百分比）为21.8%。各位点等位基因数介于2-9之间，各等位基因的大小范围在111-334bp之间；各位点期望杂合度（He）在0.1905-1.0000之间，各位点的观测杂合度（Ho）在0.1765-0.8090之间，除个别位点外（X781、X63、Z339）期望杂合度（He）与观测杂合度（Ho）均在0.3以上；各等位基因的多态信息含量（PIC）在0.1574-0.8272之间，其中X781与Z339两个位点的PIC值在0.25以下，属于低度多态性位点；X195等5个位点的PIC值在0.25与0.5之间，属于中度多态性位点；其余的17个位点的PIC值皆大于0.5，属于高度多态性位点。经Bonferroni法校正（P <0.003）后，24个多态性微卫星位点中有9个微卫星位点偏离了Hardy–Weinberg平衡，其中有2个位点（X1214、Z167）表现出显著的杂合子缺失（Hardy–Weinberg平衡偏离指数D<0，D=(Ho-He)/He），其他7个位点表现出显著的杂合子过剩（Hardy–Weinberg平衡偏离指数D>0）。（2）ISSR-PCR法开发微卫星标记。设计的8对简并引物中用于扩增CA/GT重复单元的引物PCA6、PGT6、PTG6、PAC6能够扩增出亮度较大的弥散带，将这四对简并引物克隆后测序。将前人已经开发出的微卫星同源序列去除后，共获得含微卫星的序列114个，成功设计引物45对。多态性分析显示，23对引物扩增条带为多态，开发效率为51.1%。各位点等位基因数介于2-12之间；各等位基因的大小范围在141-324bp之间；各位点期望杂合度（He）在0.2357-1.0000之间，各位点的观测杂合度（Ho）在0.3203-0.9169之间；各等位基因的多态信息含量（PIC）在0.2894-0.8877之间，其中4个位点（B78、B96、B75、D30）PIC值在0.25-0.5之间，属于中度多态位点，其他位点的PIC值都大于0.5，属于高度多态位点。经Bonferroni法校正(P <0.003)后，23个多态性位点中6个微卫星位点偏离了Hardy–Weinberg平衡，其中有三个位点（B96、B73、B92）表现出显著的杂合子缺失（Hardy–Weinberg平衡偏离指数D<0，D=(Ho-He)/He），另外三个位点（A89、 B75、 C2）表现出显著的杂合子过剩（Hardy–Weinberg平衡偏离指数D>0）。（3）微卫星序列特征分析对391条含微卫星重复的序列进行统计分析（图3-7），发现获得的微卫星序列长度范围在60-852bp之间，100bp以下的最少（16个）。大部分克隆片段大小在200bp以上，占总序列的83.1%。日本沼虾的微卫星序列中以二核苷酸重复最为丰富，占所有微卫星序列类型数目的92.4%，其次是三核苷酸（1.8%）或四核苷酸重复(1.6%)。二核苷酸重复中以（CA/GT）n类型所占比例最高，占总微卫星序列数的68.3%，其次是（GA/CT）n型，占25.1%，此外还有少量的（TA/AT）n型和（GC/CG）n型，分别占2.8%和0.6%。2.4个日本沼虾群体遗传结构分析利用8个微卫星标记（A28、A73、B13、B29、B44、B93、D7、Z337）对太湖、东平湖、微山湖、长江下游（崇明岛附近水域）4个群体的遗传结构进行分析，4个群体中长江下游（崇明岛附近水域）群体的平均等位基因数最多，为13.5000，其次是微山湖群体为12.2500，太湖群体最低为11.87。微山湖群体的平均期望杂合度和观测杂合度最高，分别为0.8403和0.8350；长江下游（崇明岛附近水域）群体的最低，分别为0.7145和0.7909。各群体间遗传距离分析显示，微山湖和东平湖群体的遗传距离最小，为0.0158；长江下游（崇明岛附近水域）和微山湖的遗传距离最大为0.3844。各群体间的遗传相似度分析也得出了类似的结果，微山湖和东平湖的遗传相似度最大（0.9162）；长江下游（崇明岛附近水域）和微山湖的遗传相似度最小（0.6312）。基于遗传距离的NJ和UPGMA聚类分析得到了相同的结果，东平湖群体和微山湖群体遗传距离最小首先聚类为一支，再与太湖群体聚为一支，最后和长江下游（崇明岛附近水域）群体聚类为一支。聚类分析的情况和实际的地理距离相符。4个日本沼虾群体的分子方差分析（AMOVA）显示，群体中89.29%的变异来源于个体内，仅有4.18%的变异来源于群体间，6.52%来源于群体内个体间，显著性检验分析显示这4个群体遗传分化极显著（P <0.01）。4个群体两两间遗传分化指数Fst从0.0031到0.0739，其中东平湖群体与长江下游（崇明岛附近水域）群体、微山湖群体与长江下游（崇明岛附近水域）群体的0.05<Fst <0.15，属于中等分化程度；其他群体间的Fst值均<0.05，分化程度较弱。日本沼虾群体的遗传结构分析对其种质资源保护和合理挖掘利用具有重要意义。（3）性别相关标记的筛选：在利用15雌和15雄日本沼虾对开发的47个微卫星标记进行多态性分析时，我们发现有8个SSR标记出现了雌性或雄性特异的等位基因。为此，我们合成了这8个微卫星标记的上游荧光引物，利用荧光SSR法，对另外的15雌和15雄日本沼虾进一步进行分析、验证。结果显示，有7个微卫星标记检测到了雌性或雄性特异的等位基因（等位基因出现次数在2次以上）。首先利用2个雌性个体和2个雄性个体对64对AFLP引物的扩增情况进行了筛选，对其中的9对引物进一步利用15个雌性个体和15个雄性个体进行大量分析。有8对检测到分布频率雌雄差异显著的等位基因，其中雄性占绝大多数（90.9%）的等位基因有1个，雌性占绝大多数（84.6%）的等位基因有2个，可为日本沼虾性别决定机制研究提供参考。 

1. 引言

 

1.1 分子标记技术简介

1.1.1 RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）标记
RFLP 即限制性片段长度多态性，是 20 世纪 80 年代发展起来的以 DNA-DNA 杂交为基础的第一代遗传标记（Bostein 等，1980），Dodgson 等（1997）认为其打响了基因组革命的第一枪，标志着生物科学进入了一个全新的时代。其基本原理是基因组DNA 由一种或者多种限制性内切酶识别并切割后产生具有长度差异的 DNA 片段，所产生的 DNA 数目和各个片段的长度反映了 DNA 分子上不同酶切位点的分布情况。基因组 DNA 经限制性内切酶酶切后，可在琼脂糖胶上进行分离。为便于进一步分析，电泳分离已经经过内切酶消化过的这些片段，转移到固体载体如硝酸纤维素膜或者尼龙膜上。然后用标记的 DNA 片段作为探针与目的片度进行杂交，杂交后洗脱非特异性探针，只留下与特定位点杂交结合的探针。将膜置于放射性自显仪下观测差异的条带。

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1.2 微卫星位点分离方法
相比其他的分子标记，微卫星凭借其多态性高、呈孟德尔式遗传（共显性）、重复性强等优点，受到遗传学家的重视，被迅速用于遗传连锁图谱的建立、种质鉴定、群体遗传学研究以及种群结构研究等方面。但是开展微卫星标记相关研究时，首先要获得微卫星位点的序列信息，并根据其侧翼保守序列设计微卫星引物。目前，常用的分离微卫星位点的方法主要有：（1）传统方法（2）微卫星富集法（3）数据库查找法（4）近缘物种筛选法（5）FIASCO法

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2、材料与方法

 

2.1 试验用日本沼虾

本试验用于开发微卫星标记和多态性分析的日本沼虾于 2009 年 8 月，捕自高楼乡附近的微山湖中，共采集 60 只（图 2-1），活的日本沼虾运至泰安后，解剖取肌肉保存于 95%酒精中或直接将肌肉冷冻在-20℃冰箱中。

本试验用于群体遗传结构分析的日本沼虾共从 4 个地点采集：太湖日本沼虾群体采自太湖靠近无锡淡水渔业研究中心水域，共采集 90 只；东平湖日本沼虾群体捕自东平湖，共采集 30 只；微山湖日本沼虾群体捕自微山湖中，笔耕文化传播，共采集 45 只；长江下游（崇明岛附近水域）日本沼虾群体 40 只从长江下游崇明岛附近水域中采集（表 2-1）。

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2.2 试剂和仪器
Tris 碱、EDTA、氯化钠、氢氧化钠、甲醇、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、亲和硅烷、剥离硅烷、碳酸氢钠等生化试剂购自 Promega 公司和天根生物有限公司。磁珠购自 Promega 公司；生物素探针、pBR322/MspI 分子量标记、大肠杆菌感受态细胞、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、DNA 连接试剂盒购自天根生物有限公司；TaqDNA 聚合酶、RNase A、dNTPs 购自 Takara 生物工程有限公司； MseI 内切酶购自NEB 公司；微卫星建库用的接头、T3 和 T7 引物、微卫星引物、MseI-N 引物由上海生物工程有限公司合成。IRDye  Fluorescent AFLP  Kit for Large Plant Genome Analysis试剂盒购自北京君意东方电泳设备有限公司。

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3、结果.............................. 34
3.1 FIASCO 法开发多态性微卫星标记..................... 34
3.2 ISSR-PCR 法开发微卫星标记结果.................................. 42
3.3 开发的微卫星序列特征分析 ..................... 48
3.4 4 个日本沼虾群体遗传结构分析 ....................... 50
3.5 日本沼虾性别相关分子标记筛选......................... 57
4.讨论............................... 64
4.1 微卫星标记的开发 ........................ 64
4.2 微卫星二核苷酸的重复类型 ......................... 67
4.3 群体遗传结构分析 ................68

4.4 性别相关分子标记 .................... 70

 

4.讨论

 

4.1 微卫星标记的开发

4.1.1 微卫星位点的分离方法

大量分离鉴定微卫星标记的最简单的方法是构建小片段微卫星的富集文库（Orsrander 等，1992；Lyall 等，1993；Kijas 等，1994；Zane 等，2002）。构建富集文库的方法有很多种，例如选择性杂交法（尼龙膜富集法和磁珠富集法）、RAPD 富集法、ISSR-PCR 法、FIASCO 法等。富集微卫星位点的方法通常包含用含串联重复序列的探针与适当酶切的基因组 DNA 片段进行选择性杂交，再通过 PCR 扩增相关的片段。在各种富集方法中，尤其以 FIASCO法应用的最为广泛。在本研究中，应用 FIASCO 法开发微卫星位点时，共获得含微卫星的序列 337个，其中成功设计引物 110对（占总序列的 32.6%），最终成功获得多态性微卫星引物24 对，开发效率（即多态性引物占总设计引物的百分比）为 21.8 %。这与其他研究者用该法分离水生生物的微卫星时得到的开发效率相类似.

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5.结论

 

本论文的研究结果总结如下：
1.日本沼虾多态性微卫星标记的开发
本论文通过 FIASCO 法和 ISSR-PCR两种方法开发多态性微卫星标记，共挑选 835个阳性克隆进行测序，成功获得序列 448 条，其中不含微卫星重复序列的有 57 个，含微卫星重复序列的有 391个，占全部序列总数的的 87.3%。用 FIASCO 法开发微卫星标记，共获得含微卫星的序列 334 个，成功设计引物110 对， 24 对引物扩增出的条带为清晰稳定的多态，开发效率（多态性引物占总设计引物的百分比）为 21.8%。用 ISSR-PCR 法开发微卫星标记，共获得含微卫星的序列114 个，成功设计引物 45 对。多态性分析显示，23 对引物扩增条带为多态，开发效率为 51.1%。

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本文编号：10830