基于DNA提取条形码技术的鱼翅物种鉴别研究

发布时间：2015-01-31 15:03

 

【摘要】 鱼翅是我国传统“海八珍”之一，属于高值水产加工品，伴随我国经济的发展，鱼翅消费量逐年增大，鱼翅市场上也因此浮现出诸多乱象。某些商贩将明胶等材料或者鳐类鱼翅标注为鲨鱼鱼翅进行贩卖干扰鱼翅贸易的正常进行，而不法分子捕捞濒危物种进行割取鱼翅不仅对鱼翅贸易造成了较大阻碍，也人为加重了某些鲨类的濒危程度。为了规范鱼翅市场，打击濒危物种的贸易并避免欺骗消费者现象的发生，鉴于此，进行鱼翅物种鉴别具有重要意义。传统的鱼翅鉴别主要通过感官鉴定法开展，感官鉴定法能够提供一定的鱼翅商品名分类信息，但无法提供准确的鱼翅物种来源信息。鉴于DNA条形码在水产品物种鉴定中运用广泛，准确性高等原因，本文基于DNA条形码方法进行鱼翅物种鉴别的相关研究。鱼翅为鲨鱼鱼鳍中的角质鳍条，属于致密结缔组织，细胞含量不丰富。本文中研究的鱼翅样品为市场上最为常见的明翅，即一种半加工形态鱼翅制品。此类鱼翅是经由鲨鱼鱼鳍通过褪沙（去皮），去除残肉与软骨，漂白晒干等加工步骤得到的。上述原因造成了鱼翅DNA提取的困难。为了获取能够满足条形码鉴定所需的DNA，本文针对鱼翅特性采用了发制-冻干的前处理方法进行鱼翅组织破碎，选取了Chelex-100螯合树脂法，STE法，经典CTAB法以及试剂盒纯化法用于鱼翅DNA提取效果的比较以选取最佳方法。根据比较结果，针对CTAB提取方法中的进行了多个步骤的优化与改进，提出了改良CTAB法用于鱼翅DNA提取。根据DNA浓度值/纯度值以及PCR扩增成功率，改良CTAB法能够获得较好的鱼翅DNA提取效果。为了准确进行国内水产市场中鱼翅制品的物种来源调查，本文选取了我国北方鱼翅贸易中心城市青岛及占全国鱼翅贸易总量90%以上的广东省分别进行采样。本文针对共计例107鱼翅样品进行了DNA条形码鉴别研究。除了选取COⅠ（cytochrome oxidase subunit Ⅰ）外，还着重考虑了使用16SrRNA编码基因进行鱼翅鉴别的可行性与准确性。针对鱼翅样品的物种鉴定结果显示：鱼翅的物种来源较丰富，涵盖不同鲨类10种，如尖吻鲭鲨，路氏双髻鲨，镰状真鲨，大青鲨等；基于16SrRNA序列的鉴定结果与基于COⅠ序列的鉴定结果一致。多数样本与已知物种的现有序列之间能够在聚类关系中形成单系，其中来源于灰鲭鲨属尖吻鲭鲨的鱼翅样品的存在两类聚类关系，基于两基因的聚类关系一致。而针对真鲨属不同种的鉴定结果显示，16SrRNA未能鉴别出来源于杜氏真鲨与蒂氏真鲨的鱼翅样本，进一步分析显示，这是由于NCBI中相关序列（全基因组及16S相关基因）的缺少所造成的，同时也表明基于16SrRNA在进行真鲨属不同鲨鱼物种鉴别水平上的准确性。可以得出结论，16SrRNA基因适用于常见鱼翅的物种来源鉴定。本文针对鲨鱼物种进行分析显示，存在两类双髻鲨类（路氏双髻鲨与锤头双髻鲨）为华盛顿公约附录Ⅱ中禁止国际贸易的物种，所占比例达到所检鱼翅的14.01%，上述两类鲨鱼及其相关制品属于我国二级重点保护动物，其相关贸易违反了我国现有法律条例。此外，所检鱼翅样品存在大眼长尾鲨、尖吻鲭鲨等根据红色名单划分属于“易危”类别，虽然我国现目前并没有针对此两类鲨鱼制定强制性法律要求，但世界范围的渔业管理部门已将此两类鲨鱼作为重点保护对象，应当控制其及其制品的相关贸易。鉴于上述现象，亟需基于物种水平的实施鲨鱼资源管理特别是鱼翅物种来源鉴定及管理措施，以保护濒危特种鲨鱼并维持鲨类资源可持续利用。

第 1 章  绪  论

法医DNA 检验技术的主要对象是生物物证，即人的细胞核基因组 DNA。法医DNA 检材一般分为常量检材、微量检材、接触检材等。 常见的常规检材包括人血、唾液和混合斑等。本文中涉及的常量检材主要指血痕和唾液斑。标准的血斑载体包括FTA 卡、滤纸、纱布（线）、棉签，部分唾液斑是送检烟蒂。这些常见的载体中，纱布（线）长时间保存DNA 的效果较棉签差；棉签不利于DNA 分子的释放；滤纸长时间浸泡可能会使溶液中漂浮纸纤维；烟蒂过滤嘴部位的烟纸通常是含色素的；标准 FTA卡含有特殊成分，能更大限度防止 DNA 降解，但纯水浸泡清洗时不容易去除血色素。因此，对不同的检材载体，需要分别研究其最佳提取量；另外，常量检材在提取、保存、送检的过程中可能会存在不同程度的 DNA 降解、含有各种杂质等现象，所以提取过程中的体系体积、加入的Chelex-100 及蛋白酶 K 的量、消化时间、变性时间，甚至浸泡清洗过程都可能会对提取的DNA 模板质量产生影响。Chelex-100 提取法的不足之处是原始检材的所有成分，包括蛋白、肝素、血红素以及检材基质中所含的染料等各种杂物都在提取后的 DNA 液中，有时可能会对DNA 扩增产生影响[8]。长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素；但同时清洗检材时可能损失部分 DNA，所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA 之间的关系。 但是，由于Chelex-100 法有DNA 提取时间短、提取方法简便、成本不高，提取过程不换管，减少了可能造成检材污染的环节等优点，同时，在Chelex-100 法的基础上还可以对DNA 提取进行各种纯化，目前，Chelex-100法已经成为法医DNA 提取的基本方法。
.........

第 2 章 实验材料与方法

2.1 材料、仪器和试剂
为最大限度降低其他条件对实验结果的影响，每个对照组所用的检材及试剂均采用同一来源的，不同对照组（即编号前两位字母一致的检材）尽量在同一条件、同一时间、同一台机器上进行提取、定量、扩增、电泳。 降解检材及腐败检材因DNA含量不定且含有大量DNA扩增干扰物，为提高检验一次成功率一般采用磁珠法，不在本实验讨论范围内。Chelex-100浓度：分别剪取0.2cm×1.0cm  FTA血卡溶于100μL 5% chelex-100、10% chelex-100、15% chelex-100、20% chelex-100，编为BB组。 蛋白酶K：在0.2cm×1.0cm FTA血卡+100μL chelex-100体系中，分别加入3μL、5μL、8μL、10μL、20μL蛋白酶K（PK），编为BC组。 56℃消化时间：对0.2cm×1.0cm FTA血卡+100μL chelex-100+10μL PK体系，分别56℃消化30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟，编为BD组。 98℃变性时间：对0.2cm×1.0cm FTA血卡+100μL chelex-100+10μL PK体系，分别98℃变性3分钟、5分钟、8分钟、10分钟、20分钟，编为BE组。

2.2 方法
剪取适量生物检材，置于0.5ml 离心管内，加入适量纯水，震荡 30 秒，室温浸泡 20 分钟[33]， 13,000rpm 离心 5 分钟，，吸弃上清，管底留约 20μl左右液体及检材基质，加入 30—150μl  Chelex-100 及 PK 5-20μl，56℃ 30 至 90 分钟不等，100℃ 5-20 分钟，10,000rpm 离心 2 分钟，上清备用[34]。取适量唾液斑样品，放入 0.5ml 的离心管中，加入 0.5ml 纯水，振荡混匀30 秒，室温浸泡30 分钟；13,000rpm离心3 分钟，去除上清液，保留载体；加入 100μl 10% Chelex-100 溶液和 5μl PK，56℃保温 1 小时，振荡5-10 秒；98℃变性15 分钟，振荡30 秒；13,000rpm 离心2 分钟，4℃保存备用。扩增效果可能受环境温度、扩增试剂盒存放时间、扩增液混匀程度等因素影响，因此，根据国家实验室认可委（CNAS）关于 DNA 实验室认可的相关要求，每次扩增时，应该同时扩增control DNA（9947）以作阳性对照，观察扩增效果；以扩增纯水作为阴性对照，观察有无体系污染。

第2 章  实验材料与方法.....................15

2.1 材料、仪器和试剂.....................15

2.2 方法.....................22

第3 章  结果与讨论.....................27

3.1 Qubit2.0 定量结果.....................27

3.2 电泳结果.....................44

第4 章  结论.....................64

第 3 章  结果与讨论

3.1 Qubit2.0 定量结果
检材量对照组：将常量生物检材按载体材质分为组，每小组取5个样本尽量保持相同条件进行试验，以观察平均值。 抗凝血：分成1-5天、6-15天、15天以上共三大组，分别编为AA、AB、AC组，每组混匀后分别用移液器抽取5μL、10μL、15μL、20μL，进一步分小组。 血纱：剪取0.3cm长纱线，每组分别放入1-5根纱线，编为AD组。 棉签：表层带血处剪取0.3 cm×0.3 cm、0.3 cm×0.5 cm、0.3 cm×0.8cm、0.3cm×1.0 cm，编为AE组。 滤纸：血斑中心处剪取0.3 cm×0.3 cm、0.3 cm×0.5 cm、0.3 cm×0.8cm、0.3cm×1.0 cm单层滤纸，编为AF组。 FTA卡：血斑中心处剪取0.3 cm×0.3 cm、0.3 cm×0.5 cm、0.3 cm×0.8cm、0.3cm×1.0 cm单层滤纸，编为AG组。

3.2 电泳结果
加入5%浓度Chelex-100的对照组（BBA1-5）的电泳峰值略低于高浓度（10%、15%、20%）的对照组，但是相差不大。这说明5%浓度的Chelex-100已足够使用，虽然考虑到Chelex-100本身的特性、适当提高浓度以防止大批量提取过程中不能吸取到Chelex-100颗粒影响提取结果的情况是必要的，也不需要配置过高浓度的Chelex-100造成试剂的浪费。 在0.2cm×1.0cm FTA血卡+100μl chelex-100体系中，加入5μl以上的蛋白酶K基本上提取DNA的质和量就不会再随着加入的试剂增加而进一步。即在此体系中，蛋白酶的浓度已经足够消化细胞膜、释放出DNA分子了，提高PK加入量并不能优化电泳结果。
...........

第4章 结论

STR-PCR 已在法医 DNA 领域开展了近 20 年，但国内外法医 DNA 实验室的主要科研力量始终未重视常量检材的提取这一看似普通但应用最广、对日常检验工作影响最大的领域。 本研究通过一系列对照试验，结合 DNA 定量仪读数和 ABI 基因分析仪3130xl 电泳结果，确定了 DNA 实验室几种常见载体的常量检材提取过程中的最佳提取体积（100μl）、Chelex-100 最低浓度（5%）和 PK 最小加入量（5μl/100μl）、能保证DNA 充分释放和解链的56℃消化时间（45 分钟）和98℃变性时间（8 分钟）。 同时，通过提取同一载体不同量检材的对照实验，提供了一个常量检材法医DNA 实验室各种常见载体的提取检材量的参考值。
..........

参考文献：

[1] 柳燕,李莉,赵珍敏,张素华,赵书民.  甲醛固定石蜡包埋组织STR分型检测[J]. 法医学杂志. 2009(05)
[2] 杨电,刘超,徐曲毅,胡慧英,刘宏.  微量口腔脱落细胞检材的DNA检验[J]. 法医学杂志. 2008(02)
[3] 赖跃,王传海,秦洁,景强,李晓斌,徐振波,李尉源,王琦.  8种方法显现的汗潜指印STR分型研究[J]. 中国法医学杂志. 2007(06)
[4] 张晓红,张毅,唐建新,刘超.  指甲垢中异体DNA的检验[J]. 中国法医学杂志. 2007(04)
[5] 姜先华,侯光伟,李军,于蛟.  应用DNA工作站进行批量血斑STR分型的研究[J]. 中国法医学杂志. 2007(01)
[6] 彭建雄,周毅,陈松,张大安,李万水,郝金萍,张海兵,徐秀兰.  一种收集衣服上脱落细胞的新方法[J]. 刑事技术. 2006(05)
[7] 王欣,徐振波,徐丽莹.  从牙刷提取DNA检验1例[J]. 法医学杂志. 2006(02)
[8] 周毅,黄玉柱,张大安,李万水,陈松,杨秋妹.  头盔上附着微量DNA的检验1例[J]. 刑事技术. 2005(05)
[9] 王德明,顾丽华,阎建军,平原,陈荣华,唐建平,郑会芬,糜忠良.  3种提取胶带粘面汗潜指印中DNA的方法比较[J]. 中国法医学杂志. 2005(02)
[10] 顾丽华,平原,阎建军,王德明,陈连康,顾明波,郑秀芬,周怀谷,江涛,李棨,郑会芬,唐建平,尚宝良,胡伟,张晨.  汗潜指印的STR分型检测[J]. 中国法医学杂志. 2003(06)


本文编号：11749