基于磁性微粒的法医样本DNA纯化及STR分型研究

发布时间：2015-02-02 09:27

 

【摘要】 近年来,法医DNA数据库构建的工作量愈来愈大,对血斑样品大规模自动化提取的需求亦愈来愈大。此外,一些重大案件法医DNA检验过程常会碰到各种疑难生物检材,这些检材多为少量甚至痕量、还会受到周围环境的影响而导致DNA分子受损或DNA链断裂。但这些检材往往又是侦查破案的唯一线索,对疑难生物检材DNA的提取环节变得尤为关键,也成为制约法医DNA分析的“瓶颈”。因此,选择高性能的DNA纯化方法成为法医DNA建库和案件分析的首要条件。目前,用于法医样本DNA纯化的方法主要有酚-氯仿抽提法、Chelex-100法和磁性分离法。相比酚-氯仿抽提法和Chelex-100去,磁性分离法不仅克服了传统方法需要离心、操作繁琐、污染环境等缺点,同时还可以配套自动化仪器,满足样品纯化高通量的需求。本课题以二氧化硅磁性微粒为载体,以血斑为实验样本,通过对纯化过程中的裂解、结合、清洗、洗脱四个环节的优化,确立了血斑样本DNA纯化的方法,并对纯化所得的DNA进行荧光定量检测,对批间差、批内差以及方法的稳定性做了系统评价；与同类产品进行比较,以PCR-STR分型检测对方法的性能进行了的评价。结果表明：用该方法可以从直径为5 mm2的血斑样本中得到50-70 ngDNA;方法具有较好的稳定性,平均批内差为9.23%,批间差为12.36%；与国内外产品进行比较并进行STR复合荧光扩增,表明该方法不仅满足STR分型检测的需要,而且还可跟市售的同类产品相媲美,用本课题建立的方法得到的DNA不含PCR扩增抑制剂。将优化的体系用于唾液、指甲、烟蒂、头发、拭子等多种微量样本的DNA纯化,并以下游PCR-STR分型检测进行验证。结果显示,用该方法得到的DNA用于PCR-STR分型,16个STR基因座均得到了正确分型结果。说明方法同样适用于多种法医生物检材,并且能够得到较好的分型结果。 

第一章前言

人类基因组以染色质的形式存在于细胞核内,在各类案件或事件现场所留下的生物检材,只要含有一定数量的有核细胞或破碎的细胞核,均可以提到基因组DNA随着法医DNA分析技术的发展,DNA在法庭科应用也变得越来越重要,相比DNA分析技术。法医DNA检验常常需要从各种微量甚至痕量的检材中提取基因组DNA的发展,法医疑难检材的DNA高效提取是法医DNA检验成功的重要一前提。针对这一现状,国外许多公司已经开发和研制了以磁珠法为载体的法医样本DNA纯化试剂盒,并且实现了DNA纯化和分析的自动化。国内对这方面的研究较晚,目前我国法医DNA建库试剂80%以上均为国外试剂。基于以上原因,本课题组提出了以自主开发研制的磁性微粒为载体建立法医样本的DNA纯化方法。本研究的主要工作包括以磁性微粒为载体,建立法医样本DNA纯化的方法。对以磁性微粒为载体的法医样本DNA纯化方法进行系统全面的评价和验证。将建立的法医样本DNA纯化方法应用于多种法医检材,使建立的方法适用于多种生物检材。
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第二章基于磁性微粒的法医样本核酸纯化方法的建立

2.1实验材料及仪器
目前针对法医样本的DNA纯化方法使用最广泛的是酚一氯仿抽提法, 这些方法存在操作复杂,过程繁琐,污染环境且不易实现自动化等弊端,与此相比,磁性微粒应用于DNA纯化克服了以上缺点,具有明显的优势。应用磁性微粒纯化法医样本DNA在国外已经批量生产,许多公司已经推出了相应的DNA纯化试剂盒并使DNA纯化迈入了自动化的阶段。但是,国内对这方面的研究较为落后。基于以上原因,本文建立以自主开发研制的二氧化硅磁性微粒为载体建立法医样本的DNA纯化方法。以二氧化硅磁性微粒为载体,建立法医样本的DNA纯化方法,主要包括样本的裂解,DNA的结合, 非特异性吸附的清洗及DNA洗脱这四个环节,方法示意图如图2-1。

2.2实验方法
核酸在细胞中以染色质的形式与各种蛋白质结合的形式存在于细胞核内,对于核酸的分离纯化主要是将核酸与蛋白质、脂肪、多糖等生物大分子分离开。一般来说,核酸分离纯化的方法大多都包括细胞裂解,酶处理,核酸与生物大分子分离、核酸纯化这几个主要步骤。其中最主要一步就是对细胞的裂解,细胞只有得到充分的裂解,才能使遗传物质完全的释放出来,得到更多的DNA,提高纯化效果所以选择合适的裂解液就变得有为的重要。裂解液的作用主要有以下几个方面①能够破坏脂质双分子层,破裂细胞②能够使蛋白变性,并能够抑制蛋白酶活性。对于裂解条件的确定主要通过正交试验的方法来进行,一般来说,影响样本裂解的因素除了裂解液外,裂解温度、裂解时间也是影响裂解效果的重要因素,因此对于裂解条件的确定主要通过正交试验的方法来进行,实验确定的因素包括裂解液外、裂解温度、裂解时间,分别记作ABC,并且每个因素均取三个水平.

第三章磁性微粒用于法医样本核酸纯化方法的评价.........…39
3.1实验材料和使用仪器…39
第四章法医微量检材的基因组入纯化……45
4.1实验材料和使用仪器……45
4.2实验部分.........46
全文总结...........55

第四章法医微量检材的基因组DNA纯化

 

4.1实验材料和使用仪器
对于法医STR检验来讲,主要是通过检验细胞核中的人基因组DNA来进行个体识别或亲缘关系鉴定。通常使用的生物样本有血液、精液、组织、唾液、毛发和骨头等。以建立的磁性微粒为载体的血斑样本纯化方法进一步应用到口腔拭子、烟蒂、指甲、头发等多种法医样本的DNA纯化,得到的DNA进行STR荧光复合扩增来验证方法的可靠性。

4.2实验部分
检材处理注意事项口腔拭子的准备,清水漱口三遍,用口拭子棉签在口腔两侧轻轻地擦拭,阴干,备用。对于口腔拭子需要注意的是,口腔粘膜细胞用肉眼是看不见得,所以对于口腔拭子来说,取材的部位就变得非常的重要,通常剪取含有口腔粘膜细胞的口腔棉签外围薄博的一层,如果将整个口腔拭子棉签进行裂解,可能会因为口腔棉签中的杂质影响纯化的效果。对于烟蒂的纯化需要注意的是因为口腔粘膜细胞用肉眼是看不见得,所以对于烟蒂来说,取材的部位就变得非常的重要。一般来说,对于有明显咬痕的烟蒂我们通常剪取位于咬痕部位以上的部分,对于没有明显咬痕的烟蒂,则尽量剪取烟蒂的上端,DNA数据库的建立在法庭案件侦破中的作用越来越重要,随着DNA库大规模的建设,DNA提取,加样等步骤成为制约DNA数据库建设的“瓶颈”,为了迎合DNA数据库的快速建设,将本文建立的DNA纯化方法进一步的调整使之能自与动化核酸提取仪配套使用,使该方法具有更广泛的应用范围。
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全文总结

以血斑样品做为实验样本,确立建立的以磁性微粒为载体的法医样本DNA纯化的方法,通过对裂解、结合、清洗、洗脱这四个环节进行优化,经过荧光定量对该方法纯化得到的DNA定量,可从直径为5mm的血斑样本中得到50-70ngDNA。通过使用本文建立的方法对口腔拭子、烟蒂、指甲、头发等对多种法医生物检材进行DNA并用得到的DNA进行下游STR分型检测,结果显示本文建立的法医样本DNA纯化方法可适用于多种生物检材通过用该方法, 结果表明,用该方法得到的DNA进行STR分型结果成功率达到85%,本文建立的以磁性微粒为载体的法医样本DNA纯化方法效果更好同时,将该方法稍作调整也可以和自动化的仪器配套使用。

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本文编号：11771