铅锌胁迫下普陀山苔草（Carex putuoshan）植物络合素合酶基因应答初步研究

发布时间：2017-10-24 11:30

  本文关键词：铅锌胁迫下普陀山苔草（Carex putuoshan）植物络合素合酶基因应答初步研究

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【摘要】：植物在进化过程中形成了一系列重金属胁迫的响应机制,植物络合素(Phytochelations,PCs))即是其中之一,它在植物响应重金属胁迫过程中发挥着重要的作用。植物络合素(PCs)不是由基因直接编码合成,而是由植物络合素合成酶(Phytochelatin synthase,PCS)催化完成。本课题选取铅超富集植物普陀山苔草(Carex putuoshan)为对象,以非富集植物金叶苔草(Carex Evergold)为对照,通过铅锌胁迫处理,研究胁迫条件下普陀山苔草的应答模式,特别是通过植物络合素合酶基因在铅锌胁迫下不同时间的组织表达特点,以及该基因的结构、进化关系及蛋白三维结构的系统研究,从而对普陀山苔草铅超富集的分子机制进行探讨,为铅锌重金属污染土修复的植物培育奠定基础。主要结论如下：(1)实时荧光定量PCR分析结果显示,铅锌胁迫下普陀山苔草植物络合素合酶基因(CpPCS)及金叶苔草植物络合素合酶基因(CePCS)表达量均升高,CpPCS的表达模式是普陀山苔草超富集铅机制的重要组成部分。铅(600mg/L)、锌(125mg/L)、铅锌复合(Pb 600mg/L；Zn 125mg/L)胁迫下,CpPCS及CePCS在叶中的表达量显著增加,远大于在根中的增加量,这解释了普陀山苔草地上部分铅富集量高于地下部分;铅(600mg/L)、锌(125mg/L)、铅锌复合(Pb 600mg/L；Zn125mg/L)胁迫下,CpPCS及CePCS的表达量大部分随着时间变化呈现先升高后略微降低再升高的趋势；研究表明：铅锌复合(Pb 600mg/L；Zn 125mg/L)胁迫36h后,普陀山苔草叶片CpPCS基因表达量达空白对照组的12倍,是同期处理条件下金叶苔草CePCS表达量的8倍,其CpPCS蛋白酶活也是CePCS的8倍。故CpPCS蛋白催化合成的PCs结合铅离子的量远高于CePCS蛋白,这是普陀山苔草铅超富集的酶活重要特征。(2)普陀山苔草植物络合素合成酶基因克隆及编码蛋白结构研究表明：普陀山苔草CpPCS基因的开放阅读框由1461个碱基组成,编码一个含有486个氨基酸残基的蛋白,其等电点为6.12,分子量为53.86Kda,预测脂肪系数为87.65,不稳定系数为47.56,为不稳定蛋白,亚细胞定位预测CpPCS蛋白定位于细胞核。经BLAST比对发现,普陀山苔草络合素合酶结构域,与玉米、芦苇、大蒜、粉蓝烟草的PCS氨基酸序列相似性分别为64%、63%、63%、63%。CpPCS有19个半胱氨酸(Cys)残基散布在蛋白的不同区域上,并组合成五个Cys-(Xaa)n-Cys(n=0-5)元件,这些元件是响应铅锌胁迫的重要功能元件。预测CpPCS蛋白的亲水性平均系数为-0.094,所以为亲水性蛋白。CpPCS蛋白有两个跨膜区域。从普陀山苔草CpPCS蛋白的三维结构预测看,与拟南芥AtPCS1蛋白、蜈蚣草PvPCS蛋白以及印度芥菜BjPCS1蛋白三维结构比较,具类似空间结构。进化树构建表明：普陀山苔草CpPCS与狗牙根及芦苇等单子叶植物亲缘关系最近。
【关键词】：普陀山苔草 铅锌胁迫 植物络合素合酶及基因 应答模式
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10
• 1. 国内外研究现状10-22
• 1.1 传统重金属污染土壤修复技术10-11
• 1.2 超富集植物修复重金属污染土壤11-12
• 1.2.1 超富集植物11
• 1.2.2 超富集植物普陀山苔草11-12
• 1.2.3 植物对重金属的胁迫响应机制12
• 1.3 植物络合素与植物络合素合酶12-19
• 1.3.1 植物络合素的功能12-14
• 1.3.2 植物络合素的合成与调控14-17
• 1.3.3 植物络合素合酶与植物络合素合酶基因17-18
• 1.3.4 PCS基因的克隆表达及转PCS基因植物研究18-19
• 1.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)19
• 1.5 研究目的及意义19-22
• 2. 实验材料与方法22-34
• 2.1 植物材料22
• 2.2 苔草的栽培与处理22-23
• 2.3 主要试剂23
• 2.4 主要仪器23-24
• 2.5 培养基24
• 2.6 方法24-34
• 2.6.1 普陀山苔草、金叶苔草总RNA的提取与检测24-25
• 2.6.2 3'和5'RACE-ready cDNA模板的制备25-26
• 2.6.3 RT-PCR模板的制备26
• 2.6.4 全长克隆引物设计26-28
• 2.6.5 PCR反应28
• 2.6.6 PCR产物回收纯化、TA克隆及测序28-31
• 2.6.7 普陀山苔草CpPCS基因序列分析31
• 2.6.8 qRT-PCR引物设计31
• 2.6.9 qRT-PCR检测基因表达31-34
• 3. 结果与分析34-50
• 3.1 普陀山苔草(Carex putuoshan)、金叶苔草(Carex evergold)总RNA的提取34
• 3.2 普陀山苔草植物络合素合酶基因(CpPCS)的克隆34-35
• 3.3 普陀山苔草CpPCS基因序列分析35-42
• 3.3.1 CpPCS基因序列特征35-38
• 3.3.2 CpPCS蛋白亲水性及跨膜区预测38-39
• 3.3.3 CpPCS编码蛋白结构预测39-40
• 3.3.4 系统进化树的构建40-42
• 3.4 铅锌胁迫下普陀山苔草植物络合素合酶基因应答模式分析42-50
• 3.4.1 QRT-PCR体系建立42-44
• 3.4.2 普陀山苔草铅锌胁迫下CpPCS表达量44-45
• 3.4.3 金叶苔草铅锌胁迫下CePCS表达量45-46
• 3.4.4 铅胁迫下CpPCS及CePCS表达量46-47
• 3.4.5 锌胁迫下CpPCS及CePCS表达量47-48
• 3.4.6 铅锌复合胁迫下CpPCS及CePCS表达量48-50
• 4. 讨论50-54
• 4.1 普陀山苔草植物络合素合酶基因(CpPCS)克隆及序列功能分析50-51
• 4.2 铅锌胁迫下普陀山苔草植物络合素合酶基因应答模式分析51-54
• 5. 结论54-56
• 6. 展望56-58
• 参考文献58-64
• 致谢64-65
• 攻读学位期间发表的学术论文65

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本文编号：1088573