玫瑰花青素苷合成相关基因的克隆及表达分析

发布时间：2017-10-24 11:33

  本文关键词：玫瑰花青素苷合成相关基因的克隆及表达分析

  更多相关文章： 玫瑰 花青素苷 结构基因 克隆 表达分析

【摘要】：玫瑰是蔷薇科蔷薇属重要的观花植物,现已应用于园林景观绿化、食品工业、药用产业等各个方面,具有很大的观赏价值和经济价值。花色是玫瑰的重要观赏性状之一,玫瑰品种较多,但花色单一,严重的自交和种间杂交障碍限制了玫瑰花色的创新及在国内外市场的发展。分子育种是培育新品种的新方法,目前对玫瑰花色发育的分子基础还缺乏深入研究,这在一定程度上制约了玫瑰花色的改良。花青素是植物花器官的最主要的呈色物质,在模式植物中其生物合成途径已经研究的较为详细,该途径大多数结构基因和一部分调控基因均己分离。但有关玫瑰花色形成的机理研究尚未见报道。因此对玫瑰花青素合成途径中结构基因的克隆与表达分析对于阐明玫瑰花色形成机理、利用基因工程培育新品种具有重要意义。本研究以‘紫枝’玫瑰花瓣为材料,利用RT-PCR的方法分离了4个关键结构基因(CHS、CHI、F3H、DFR)的全长cDNA序列和1个关键结构基因(ANS)的部分cDNA序列。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法,分析5个关键基因在玫瑰不同花色品种、不同开花时期的差异性表达。主要研究结果如下:1.以‘紫枝’玫瑰盛花期花瓣的cDNA为模板进行PCR扩增,获得了CHS、CHI、F3H、DFR和ANS五个结构基因的cDNA序列,命名为RrCHS、RrCHI、RrF3H、RrDFR和RrANS。其中RrCHS、RrCHI、RrF3H和RrDFR为全长cDNA序列,分别为1167bp、711bp、1092bp和1047bp,编码389、237、364和349个氨基酸,RrANS为部分cDNA序列,长度为562bp。利用NCBI的Blastp工具进行比对分析发现,5个结构基因与其它已知植物的相关基因均具有较高的同源性。5个结构基因获得的GenBank登录号分别为ALR74720.1、ALR74721.1、ALR74723.1、ALR74719.1、ALR74722.1。2.运用生物信息学分析软件对4个结构基因的蛋白分子量、理论等电点、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点和糖基化位点、二级结构及保守结构域等进行了分析,同时在多序列比对的基础上构建了系统进化树。系统进化分析表明,4个基因的系统进化树基本符合植物分类学分类,且具有较明显的种属特性。3.对玫瑰3个品种5个时期的花青素含量进行测定,结果显示:‘紫枝’玫瑰花青素苷含量远高于‘粉紫枝’玫瑰,‘白紫枝’玫瑰含量最低,3个玫瑰品种的花青素苷含量在整个开花过程中均呈逐渐下降趋势,与花色变化结果一致。4.利用实时荧光定量技术(qRT-PCR)对本研究克隆的5个结构基因(RrCHS、RrCHI、RrF3H、RrDFR和RrANS)在3个玫瑰品种(‘紫枝’玫瑰、‘白紫枝’玫瑰和‘粉紫枝’玫瑰)5个开花时期表达模式进行分析,结果表明,5个结构基因在3个玫瑰品种不同开花时期均有表达,但表达模式存在明显的差异。RrCHS和RrDFR在3个玫瑰品种的开花过程中整体上均呈下降的表达趋势,盛花末期的表达量最低。RrCHI在3个玫瑰品种中表达量都是随着花的开放逐渐增加,而后随着花的萎蔫又下降。RrF3H和RrA NS在3个玫瑰品种花朵开放过程中的相对表达量变化没有一定规律可循。此外,RrCH S、RrCHI、RrDFR与玫瑰开花过程中花青苷形成和变化密切相关,RrF3H、RrANS与花青苷含量变化没有明显的对应关系。5.利用实时荧光定量技术(qRT-PCR)对5个结构基因(RrCHS、RrCHI、RrF3H、RrDFR和RrANS)在‘紫枝’玫瑰5个组织部位(茎、叶、雄蕊、雌蕊、花瓣)中的表达模式进行分析。结果表明,5个结构基因在不同组织部位中均有表达,但表达水平差异明显。RrCHS、RrCHI和RrDFR的表达特征相似,即在花瓣中的表达量较高,在茎、叶、雄蕊、雌蕊中的表达量相对较低。RrF3H在茎、叶中的表达量较高,在雄蕊、雌蕊、花瓣中的表达量较低。RrANS在茎中的表达量要明显高于其他组织部位,推测这两个基因除参与花青苷合成外,还参与了玫瑰其他代谢过程。
【关键词】：玫瑰 花青素苷 结构基因 克隆 表达分析
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S685.12;Q943.2
【目录】：

• 符号说明4-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-21
• 1.1 玫瑰花色育种的发展现状12-14
• 1.1.1 玫瑰品种的概况12-13
• 1.1.2 玫瑰花色育种的相关研究13-14
• 1.2 花青素苷生物合成途径及相关基因的研究14-21
• 1.2.1 花青素苷生物合成途径的研究14-16
• 1.2.2 花青素苷生物合成途径中相关结构基因的研究16-21
• 1.2.2.1 查尔酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)16-17
• 1.2.2.2 查尔酮异构酶(Chalcone isomerase，CHI)17-18
• 1.2.2.3 黄烷酮 3-羟化酶(Flavonoid 3-hydroxylase，，F3H)18-19
• 1.2.2.4 二氢黄酮醇还原酶(Dihydroflavonol 4-reductas，DFR)19-20
• 1.2.2.5 花青素合成酶（Anthocyanidin synthase，ANS）20-21
• 1.3 本研究目的及意义21
• 2.材料与方法21-31
• 2.1 玫瑰花青素苷合成相关基因的克隆21-27
• 2.1.1 试验材料21
• 2.1.2 菌株和质粒21-22
• 2.1.3 主要试剂22
• 2.1.4 主要试剂配制22
• 2.1.5 主要仪器22-23
• 2.1.6 试验方法23-27
• 2.1.6.1 总RNA提取23
• 2.1.6.2 总RNA质量检测23-24
• 2.1.6.3 反转录合成cDNA第一链24
• 2.1.6.4 引物设计24-25
• 2.1.6.5 PCR反应体系和扩增条件25
• 2.1.6.6 PCR产物的检测25
• 2.1.6.7 目的片段的回收、连接和转化25-27
• 2.1.6.8 生物信息学分析27
• 2.2 玫瑰花青素苷合成相关基因的表达分析27-30
• 2.2.1 试验材料28
• 2.2.2 主要试剂28
• 2.2.3 主要仪器28-29
• 2.2.4 试验方法29-30
• 2.2.4.1 总RNA提取以及纯度与完整性的鉴定29
• 2.2.4.2 cDNA的合成29
• 2.2.4.3 引物设计29-30
• 2.2.4.4 实时荧光定量RT-PCR30
• 2.3 玫瑰花青素苷含量的测定30-31
• 2.3.1 试验材料30
• 2.3.2 主要试剂30-31
• 2.3.3 主要仪器31
• 2.3.4 试验方法31
• 3.结果与分析31-56
• 3.1 玫瑰花青素苷合成相关基因的克隆31-49
• 3.1.1 玫瑰花总RNA质量检测31
• 3.1.2 玫瑰RrCHS、RrCHI、RrF3H、RrDFR和RrANS基因的克隆31-32
• 3.1.3 玫瑰RrCHS、RrCHI、RrF3H和RrDFR的生物信息学分析32-49
• 3.1.3.1 RrCHS的序列与生物信息学分析32-36
• 3.1.3.2 RrCHI的序列与生物信息学分析36-40
• 3.1.3.3 RrF3H的序列与生物信息学分析40-44
• 3.1.3.4 RrDFR的序列与生物信息学分析44-49
• 3.2 玫瑰花青素苷合成相关基因的表达分析49-55
• 3.2.1 玫瑰花青素苷合成途径关键结构基因的时间表达模式分析49-53
• 3.2.1.1 RrCHS基因在3个玫瑰品种5个开花时期的表达分析49-50
• 3.2.1.2 RrCHI基因在3个玫瑰品种5个开花时期的表达分析50
• 3.2.1.3 RrF3H基因在3个玫瑰品种5个开花时期的表达分析50-51
• 3.2.1.4 RrDFR基因在3个玫瑰品种5个开花时期的表达分析51-52
• 3.2.1.5 RrANS基因在3个玫瑰品种5个开花时期的表达分析52-53
• 3.2.2 玫瑰花青素苷合成途径关键结构基因的空间表达模式分析53-55
• 3.2.2.1 RrCHS基因的器官特异性表达分析53
• 3.2.2.2 RrCHI基因的器官特异性表达分析53-54
• 3.2.2.3 RrF3H基因的器官特异性表达分析54
• 3.2.2.4 RrDFR基因的器官特异性表达分析54-55
• 3.2.2.5 RrANS基因的器官特异性表达分析55
• 3.3 玫瑰花青素苷含量的测定55-56
• 4 讨论56-62
• 4.1 玫瑰花青素苷合成途径中结构基因的克隆与序列分析56-57
• 4.2 玫瑰开花过程中花青素合成结构基因表达特性分析57-60
• 4.2.1 玫瑰开花过程中RrCHS基因表达特性分析57-58
• 4.2.2 玫瑰开花过程中RrCHI基因表达特性分析58-59
• 4.2.3 玫瑰开花过程中RrDFR基因表达特性分析59
• 4.2.4 玫瑰开花过程中RrF3H和RrANS基因表达特性分析59-60
• 4.3 玫瑰开花过程中花青素合成结构基因表达与花青苷积累及花色的关系60-61
• 4.4 玫瑰不同组织部位花青素合成结构基因表达特性分析61-62
• 5 结论62-63
• 创新点63-64
• 参考文献64-74
• 致谢74-75
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文75

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张玲;徐宗大;汤腾飞;张辉;赵兰勇;;‘紫枝’玫瑰(Rosa rugosa ‘Zi zhi’)开花过程花青素相关化合物及代谢途径分析[J];中国农业科学;2015年13期

2 陈跃华;许云;吴文嫱;刘林娅;黄小龙;黄东益;;参薯DaANS基因克隆及表达差异分析[J];植物生理学报;2015年06期

3 刘秀明;杨文婷;张雪萌;焦重达;姚娜;杨美英;官丽莉;李海燕;李校X;;红花查尔酮异构酶基因全长cDNA的克隆及表达分析[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2015年07期

4 罗群凤;胥猛;冯源恒;徐嘉娟;李火根;;北美鹅掌楸LtCHS基因的克隆及生物信息学与组织表达特征分析[J];林业科学;2015年05期

5 王华;李茂福;杨媛;金万梅;;果实花青素生物合成分子机制研究进展[J];植物生理学报;2015年01期

6 田玲;李斌;张晶莹;范胜栩;闫淑荣;孙君明;;大豆子粒发育过程中异黄酮合成相关酶基因的表达模式与异黄酮积累的相关分析[J];植物遗传资源学报;2014年06期

7 于晓艳;邢树堂;赵兰勇;;玫瑰与月季种间杂交障碍原因分析[J];中国农业科学;2014年15期

8 缪福俊;陈剑;孙浩;王毅;王晨晨;原晓龙;杨宇明;王娟;;七彩红竹二氢黄酮醇4-还原酶基因IhDFR1的克隆及表达分析[J];植物生理学报;2014年04期

9 许志茹;刘通;崔国新;李春雷;马静;李玉花;;芜菁二氢黄酮醇4 还原酶基因的克隆与功能鉴定[J];园艺学报;2014年04期

10 王晨晨;毕玮;王娟;周旭;杨宇明;王毅;;七彩红竹查尔酮异构酶基因IhCHI1的克隆与表达分析[J];西部林业科学;2014年02期

本文编号：1088589