水稻稻瘟病抗性基因保守结构的工程抗病性

发布时间：2017-10-27 23:38

  本文关键词：水稻稻瘟病抗性基因保守结构的工程抗病性

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【摘要】：水稻是我国重要的粮食作物,水稻的产量关乎着国家的粮食安全。在水稻生长过程中,经常会受到水稻病害的胁迫,影响水稻的产量和品质。稻瘟病是水稻三大病害之一,可在水稻生长的任何时期发病,轻者使水稻减产,严重时可以造成水稻的绝收。利用水稻稻瘟病抗性基因,使用基因工程手段获得对稻瘟病具有广谱、高效、持久抗性的品种(系),是防控稻瘟病最经济有效的途径之一。研究表明,植物的抗性基因大多编码CC/TIR-NB-LRR蛋白,通常是由C端的LRR识别效应分子,从而使LRR结构域与NB-ARC结构域互作,改变核苷酸绑定区域的位置和构象,从而产生免疫反应原始信号,最后通过N端的CC结构域介导下游的免疫反应。但是在对亚麻锈病抗性蛋白L6和L7的TIR结构域研究中发现,其TIR结构域足够触发细胞死亡反应和介导免疫反应。同样大麦白粉病抗性蛋白MLA10,其CC结构域都含有一个高度保守的EDVID基序,单独的CC结构域或者包含CC结构的MLA10片段,都可以产生免疫自激活现象。CC结构域自激活现象的发现为基因设计提供了一个新的思路。水稻稻瘟病抗性基因也是编码CC/TIR-NB-LRR蛋白,但是从来没有关于水稻稻瘟病抗性基因CC结构域自激活的报道。前期通过大量查阅文献和对水稻稻瘟病R基因序列分析,选取了7个编码CC-NB-LRR蛋白,并且CC结构域都含有一个高度保守EDVID基序的稻瘟病抗性基因作为研究对象。通过结构域的预测获得7个R基因的CC结构域,在烟草和水稻原生质体中表达,只有Pi36基因的CC结构表现出了自激活现象,明显能够触发细胞死亡反应。在拟南芥中异源表达Pi36CC增强拟南芥对白粉病的抗性。本研究基于Pi36基因的CC结构域自激活的特性,在水稻中单独表达Pi36CC,研究其自激活与水稻免疫反应的关系,揭示水稻稻瘟病抗性基因介导免疫反应的机制,探索通过基因工程获得广谱稻瘟病抗性的新途径。得到了以下结果：1、实验使用稻瘟病诱导性启动子PBZ1启动子,选取水稻稻瘟病抗性基因Pi36的CC结构域Pi36CC(1-134aa),并且加入标记基因GFP,成功的构建到植物表达载体pCAMBIA1300中,得到PBZ1::Pi36 CC(1-143)的水稻表达载体2、通过农杆菌介导的方法进行水稻粳稻品种TP309遗传转化,成功获得了含有PBZ1::Pi36 CC(1-143)水稻表达载体的To代阳性植株。在转基因专用田自然条件继代,并使用潮霉素筛选和目的基因PCR筛选的方法,得到了纯合的转基因种子。3、对转基因阳性植株接种常见稻瘟病菌,转基因水稻表现出明显的稻瘟病抗性水平的提高。病斑数量和病斑大小的计数以及稻瘟病菌生物量和Pi36CC表达量的测定结果一致表明,在稻瘟病菌的诱导下PBZ1启动子能够启动Pi36CC的表达,而且Pi36CC在水稻中表达,能够明显增强转基因水稻对稻瘟病的抗性。4、进一步对抗性相关基因的表达量的测定,发现转基因水稻抗性相关基因OsPR1a和OsPR5以及PTI相关基因KS4和NCA4表达量明显提高。说明Pi36CC能够通过介导抗性相关基因表达量的升高,从而增强转基因水稻稻瘟病的抗性。并且Pi36CC介导的抗性增强还和PTI相关。
【关键词】：水稻 稻瘟病 Pi36CC 工程抗病性
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.111.41
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 文献综述11-29
• 1.1 植物先天免疫机制研究进展11-16
• 1.1.1 病原体相关分子模式触发免疫系统(PTI)11-12
• 1.1.2 效应分子激发免疫系统(ETI)12-14
• 1.1.3 植物获得性免疫系统(SAR)14-15
• 1.1.4 植物HR反应15-16
• 1.2 水稻抗性基因研究进展16-19
• 1.2.1 水稻稻瘟病抗性基因的概述16-18
• 1.2.2 水稻稻瘟病无毒基因的概述18-19
• 1.3 植物抗病基因结构和功能研究进展19-23
• 1.3.1 植物R基因结构特点19-20
• 1.3.2 植物NBS-LRR基因结构与功能20-23
• 1.3.3 抗性蛋白免疫自激活23
• 1.4 植物诱导性启动子研究进展23-26
• 1.4.1 植物病原因子诱导性启动子24-25
• 1.4.2 植物激素诱导性启动子25
• 1.4.3 植物理化因子诱导性启动子25-26
• 1.5 植物工程抗病性的探索26-28
• 1.5.1 病原物因子工程抗病性26-27
• 1.5.2 植物R基因工程抗病性27-28
• 1.6 立题依据和研究目的28-29
• 2 实验材料和方法29-41
• 2.1 实验材料29-31
• 2.1.1 水稻材料和稻瘟病菌株29
• 2.1.2 目的抗性基因29
• 2.1.3 表达载体和转化菌株29
• 2.1.4 常用实验试剂29-30
• 2.1.5 常用实验仪器30
• 2.1.6 常用培养基与配置30-31
• 2.2 实验方法31-41
• 2.2.1 植物表达载体构建31-36
• 2.2.4 表达载体转化农杆菌36-37
• 2.2.5 水稻遗传转化和阳性株筛选37-39
• 2.2.6 转基因水稻稻瘟病抗性鉴定39-41
• 3 结果与分析41-47
• 3.1 前期实验结果41
• 3.2 表达载体构建结果41-43
• 3.3 转基因水稻阳性植株的获得43-44
• 3.4 转基因水稻稻瘟病接种结果44-46
• 3.5 水稻抗性相关基因表达量的分析46-47
• 4 讨论47-48
• 4.1 在水稻免疫系统中Pi36CC的功能47
• 4.2 抗性基因保守结构域工程抗病性途径47-48
• 5 后续研究设想48-50
• 参考文献50-59
• 致谢59-60

【参考文献】

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1 刘小红,张红伟,刘昕,刘欣洁,谭振波,荣廷昭;MDMV CP基因的克隆及其转基因玉米的研究[J];生物工程学报;2005年01期

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本文编号：1105710