油菜黄籽基因的克

发布时间：2017-10-29 13:06

  本文关键词：油菜黄籽基因的克隆、表达及分子标记的应用

  更多相关文章： 油菜 TT6 TT5 克隆 表达分析 分子标记

【摘要】：黄籽油菜较褐籽油菜具有含油量高、蛋白质含量高、种皮薄、皮壳率低、纤维素含量低等优点,因此黄籽性状在油菜育种中倍受关注。本实验室对油菜黄籽性状进行了多年的研究,已经精细定位芥菜型油菜陕北黄芥的黄籽基因于白菜A09染色体上,其同源区域位于拟南芥的第3染色体上。拟南芥种皮色突变基因TT6与TT5基因位于拟南芥第3染色体上,因此推测TT6与TT5基因为芥菜型油菜陕北黄芥的黄籽候选基因。本研究以TT6、TT5基因为黄籽候选基因,在三大类型油菜不同黄、褐籽材料中克隆这两个基因,比较分析三大类型油菜中两基因的序列及结构差异,应用生物信息学软件预测分析该基因的开放阅读框(ORF),上下游非编码区,基因编码的氨基酸序列,探讨黄色种皮形成的分子机制,为油菜黄籽转基因育种奠定基础。分析TT6、TT5两基因在芥菜型油菜(吴旗黄芥和武功芥菜)中不同组织、不同发育时期种子中的表达情况,进一步确定TT6、TT5对油菜黄色种皮形成的作用。本研究取得主要结果如下:1.芥菜型油菜TT6、TT5基因的克隆和序列分析分别在吴旗黄芥和武功芥菜的gDNA和cDNA中克隆TT6、TT5基因,结果如下:(1)在吴旗黄芥和武功芥菜的gDNA中,克隆TT6基因分别命名为BjTT6-y1和BjTT6-b1,其编码区长分别是1457bp和1513bp;克隆TT5基因,分别命名为BjTT5-y1和BjTT5-b1,其编码区长分别是1621bp和1623bp。(2)序列分析表明吴旗黄芥和武功芥菜TT6基因均含有三个外显子和两个内含子,BjTT6-b1的序列与白菜型油菜Bra036828完全一致;吴旗黄芥和武功芥菜TT6基因ORF长1077bp,编码358个氨基酸;但是BjTT6-b1和BjTT6-y1的cDNA序列的之间有7个单核苷酸位点的差异,其中第760位核苷酸在武功芥菜中为T、吴旗黄芥中为G,导致了第254位氨基酸的差异,武功芥菜中为缬氨酸(V),吴旗黄芥中为苯丙氨酸(F)。(3)吴旗黄芥和武功芥菜TT5基因均含有四个外显子和三个内含子,与Bra007142基因结构一致;BjTT5-y1与BjTT5-b1.1序列完全相同,BjTT5-y1和BjTT5-b1.1的ORF均为759bp,编码252个氨基酸;Bj TT5-b1.1和BjTT5-b1.2两序列存在4个单碱基差异,第346位核苷酸的差异(G/T),使终止密码子提前出现造成翻译的提前终止,从而使BjTT5-b1.2的ORF为348bp,编码115个氨基酸,造成蛋白结构及理化性质等方面的差异。2、三大类型油菜tt6、tt5基因的序列分析在芥菜型油菜、白菜型油菜、甘蓝型油菜三大类型中不同黄、褐籽品系中克隆这两个基因,比较分析三大类型油菜中tt6、tt5基因的序列差异。结果如下:(1)tt6基因序列在三大类型油菜中一致的差异位点有2个,分别是第510、897位。第510位点上甘蓝型油菜褐籽材料均为a,白菜油菜褐籽材料均为g;第897位点上芥菜型油菜黄籽材料和白菜油菜褐籽材料均为c,但是这两个位点的碱基差异都不造成氨基酸的改变。白菜型油菜第510、760、834位,甘蓝型油菜第30、126、378位与芥菜型油菜中的单核苷酸的差异位点相同,其中在760位核苷酸的差异造成氨基酸的改变。此外,tt6基因在三大类型油菜中芥菜型型油菜中同源性最高,其次是白菜型油菜,甘蓝型油菜中同源性最低。(2)tt5基因序列在三大类型油菜中一致的差异位点有2个,分别是第202、345位。这两个位点上白菜型油菜的黄籽材料碱基一致分别是a、g,芥菜型油菜褐籽材料的碱基一致分别是c、a,而且第202位的碱基差异(a/c)会造成氨基酸的改变(苏氨酸t/脯氨酸p)。此外,tt5基因在三大类型油菜中白菜型油菜中同源性最高,其次是甘蓝型油菜,芥菜型油菜中同源性较低。3、系统进化分析经序列分析和系统进化分析,结果如下:(1)油菜中tt6与其他物种距离由近到远依次是拟南芥、玉米和葡萄、番茄、大豆;芥菜型油菜与白菜型油菜tt6距离较近说明芥菜型黄、褐籽基因可能来源于白菜型黄、褐籽材料;甘蓝型油菜不同黄、褐籽材料的tt6基因分布较复杂,不能确定其来源。(2)油菜中tt5与其他物种距离由近到远依次是甘蓝、水稻、拟南芥、葡萄、甜橙、大豆和绿豆。白菜型油菜与甘蓝型油菜距离较近,甘蓝型油菜褐籽基因分布集中,且与brb2-tt5距离最近,推测甘蓝型油菜褐籽基因可能来源于brb2(泾阳油菜)这一褐籽材料。4、表达分析吴旗黄芥和武功芥菜bjtt6和bjtt5基因不同组织、不同发育时期种子的表达分析,结果如下:(1)bjtt6在吴旗黄芥和武功芥菜的初花期的叶片、花蕾、花,角果皮,不同时期种子中均有表达,但表达量具有明显的组织特异性,且吴旗黄芥和武功芥菜特异性表现不一致。吴旗黄芥花蕾中表达水平最高(89.216),其次是23dap种子(40.078),叶片中表达水平最低(1.325);武功芥菜9dap种子中表达水平最高(176.013),其次是16dap种子(87.862),角果皮中表达水平最低(2.116)。武功芥菜bjtt6在分别叶片、9dap、16dap种子中表达量显著高于吴旗黄芥相同组织,吴旗黄芥bjtt6在花蕾、花、23dap种子、30dap种子中表达量显著高于武功芥菜相同组织。(2)bjtt6在吴旗黄芥和武功芥菜种子发育期前期表达水平均高于种子发育后期;武功芥菜BjTT6表达量在种子发育中前期随种子发育迅速由峰值(176.013)降低至最小值23DAP(2.435),此后随种子成熟略有增加;吴旗黄芥BjTT6表达量在种子发育中前期随种子发育略有增加,表达量在23DAP时期达到峰值(40.078),此后逐渐降低至45DAP最小值(3.255)。(3)Bj TT5在吴旗黄芥初花期的的叶片,花蕾,花、角果皮、不同时期种子中表达量均较低且无明显的组织特异性;BjTT5在武功芥菜初花期的的叶片、花蕾、花、角果皮、不同时期种子中均有表达且表达量具有明显的组织特异性,武功芥菜中花蕾表达水平最高(6.922),其次是花(1.620),9DAP种子中表达水平最低(0.095)。(4)BjTT5在吴旗黄芥和武功芥菜在种子发育期前期的表达水平均低于种子发育中后期;在种子发育前期吴旗黄芥中BjTT5表达量略高于武功芥菜同一时期的表达量,种子发育中后期吴旗黄芥中BjTT5表达量均低于武功芥菜同一时期的表达量。武功芥菜BjTT5表达量在种子发育前期随种子发育迅速升高至峰值(1.123),此后随种子成熟表达量基本稳定;吴旗黄芥BjTT5种子发育的整个时期表达水平均较低,吴旗黄芥BjTT5表达量在种子发育前中期随种子发育逐渐增加,表达量在30DAP时期达到峰值(0.678),此后随种子成熟表达量逐渐降低。(5)BjTT5在种子形成发育后期表达量较前期高,说明BjTT5可能在种子发育后期类黄酮途径起作用,但是在整个种子发育期,BjTT5基因的表达水平均不高。BjTT6在种子形成发育前期表达量较后期高,说明BjTT6可能在种子发育前期类黄酮途径起作用。此外在种子形成前期吴旗黄芥与武功芥菜BjTT6的表达量存在明显的差异,故推断芥菜型油菜BjTT6与油菜种子黄、褐籽的性状形成有关。5、黄籽标记的开发根据本研究克隆获得的BjTT6-y1与BjTT6-b1基因组DNA第一个内含子内部存在的55 bp片段的缺失信息,开发了一个芥菜型油菜种皮色基因TT6特异性的共显性IP标记。6、SSR标记在种子纯度鉴定中的应用本研究利用SSR分子标记技术对甘蓝型油菜杂交种陕油16及其双亲进行了引物筛选和纯度鉴定研究获得3对引物SSR313、SSR354、SSR359,均表现共显性并利用这3对引物对陕油16杂交种进行纯度鉴定。
【关键词】：油菜 TT6 TT5 克隆 表达分析 分子标记
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S565.4
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文献综述14-25
• 1.1 油菜黄籽性状的遗传研究15
• 1.2 油菜黄籽基因的定位研究15-16
• 1.3 种皮色相关基因及克隆16-21
• 1.3.1 结构基因17-19
• 1.3.2 调控基因19-20
• 1.3.3 其他相关基因20-21
• 1.4 种皮色相关基因的表达分析21-22
• 1.4.1 油菜及近缘植物种皮色相关基因的表达分析21-22
• 1.4.2 其他植物种皮色相关基因的表达分析22
• 1.5 种皮结构及色素的研究22-23
• 1.6 本研究的目的及意义23-24
• 1.7 技术路线24-25
• 1.7.1 基因克隆24
• 1.7.2 表达分析24-25
• 第二章 芥菜型油菜TT6和TT5基因的克隆与分析25-51
• 2.1 试验材料与方法25-30
• 2.1.1 植物材料25-26
• 2.1.2 试验试剂及仪器26
• 2.1.3 载体与菌株26-27
• 2.1.4 油菜TT6和TT5基因序列的克隆27-30
• 2.1.5 油菜TT6和TT5基因序列分析30
• 2.1.6 油菜TT6和TT5基因编码蛋白的结构预测30
• 2.1.7 系统进化分析30
• 2.2 结果与分析30-48
• 2.2.1 不同种皮色芥菜型油菜TT6基因gDNA序列的克隆及序列分析30-35
• 2.2.2 不同种皮色芥菜型油菜TT5基因gDNA序列的克隆及序列分析35-36
• 2.2.3 不同种皮色芥菜型油菜TT6基因cDNA序列的克隆及序列分析36-42
• 2.2.4 不同种皮色芥菜型油菜TT5基因cDNA序列的克隆及序列分析42-47
• 2.2.5 芥菜型油菜TT6基因特有IP标记的开发47-48
• 2.3 讨论48-51
• 2.3.1 不同种皮色芥菜型油菜TT6基因的差异分析48
• 2.3.2 不同种皮色芥菜型油菜TT5基因的差异分析48-49
• 2.3.3 油菜TT6、TT5基因来源及系统进化分析49
• 2.3.4 芥菜型油菜TT6基因上游启动子区域分析预测49
• 2.3.5 芥菜型油菜TT6基因ploy（A）信号序列分析预测49-50
• 2.3.6 芥菜型油菜TT6基因特有IP标记的开发50-51
• 第三章 芥菜型油菜TT6和TT5基因的表达分析51-58
• 3.1 试验材料与方法51-53
• 3.1.1 植物材料和取样方法51
• 3.1.2 试验试剂及仪器51
• 3.1.3 Real Time PCR操作步骤51-53
• 3.2 结果与分析53-56
• 3.2.1 BjTT6基因的表达分析53-54
• 3.2.2 BjTT5基因的表达分析54-56
• 3.3 讨论56-58
• 3.3.1 TT6、TT5基因表达的特异性56
• 3.3.2 TT6、TT5基因与种皮色的关系56-58
• 第四章 SSR标记在种子纯度鉴定中的应用58-62
• 4.1 试验材料与方法58-59
• 4.1.1 植物材料58
• 4.1.2 试验试剂及仪器58
• 4.1.3 引物合成58-59
• 4.2 结果与分析59-61
• 4.2.1 特征型引物的筛选59
• 4.2.2 SSR标记用于种子纯度鉴定59-61
• 4.2.3 田间植株鉴定61
• 4.3 讨论61-62
• 第五章 全文结论62-64
• 5.1 芥菜型油菜TT6和TT5基因的克隆及序列分析62
• 5.2 芥菜型油菜TT6和TT5基因的表达分析62-63
• 5.3 芥菜型油菜黄籽基因IP标记的开发63
• 5.4 SSR标记在甘蓝型油菜杂交种纯度鉴定中的应用63-64
• 参考文献64-74
• 附录 174-75
• 附录 275-76
• 附录 376-78
• 附录 478-82
• 致谢82-83
• 作者简介83

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