《甘肃农业大学》2009年硕士论文

发布时间：2016-09-07 15:18

  本文关键词：转基因技术改良家畜的现状与趋势，由笔耕文化传播整理发布。

《甘肃农业大学》 2009年

体细胞克隆转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪

冯冲  

【摘要】： 猪肉是人类重要的动物性食品,猪肉中所含多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)大部分为ω-6 PUFAs,而对人体健康有重要价值的ω-3 PUFAs含量较少。本研究利用体细胞核移植技术首次成功生产了转ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)克隆猪,结果如下: 实验一:采用组织块培养法,建立了7个38日胎龄的纯种英系大白猪胎儿成纤维细胞系;细胞接触抑制2 d后,经流式细胞术检测发现, 80%以上的细胞处于G0/G1期。 实验二:利用脂质体介导的方法,将sFat-1基因转染至大白猪胎儿成纤维细胞,并对细胞的转染及筛选条件进行了优化。通过大白猪胎儿成纤维细胞对G418敏感性检测发现,600μg/mL的G418可以在7 d内将细胞全部杀死,因此筛选时选择该浓度较为合适。比较了脂质体采用与DNA的比例分别为10μL : 3μg、10μL : 4μg、10μL : 6μg和10μL : 7μg时的转染效率,其中脂质体与DNA的比例控制在10μL:4μgm时,筛选后所得细胞克隆数最高(20个);对筛选出的G418抗性细胞克隆中状态较好的18个进行了PCR及RT-PCR检测,PCR检测结果显示:18、3、6、12、16及17号克隆点细胞,为转基因阴性细胞;再利用RT-PCR对剩余12个PCR阳性克隆点的细胞进行RNA表达水平检测,结果4号克隆点的RNA表达量极低,认定其为转基因阴性,其余11个为阳性。 实验三:为了提高克隆胚胎的发育能力,将卵巢上的卵泡按直径分为大卵泡(直径4-6 mm)及小卵泡(直径2-3 mm)两组,体外成熟38 - 42 h后作为胞质受体,以胚胎的卵裂率和囊胚率为检验标准,评价卵泡大小及成熟时间(卵龄)对卵母细胞成熟质量的影响;胚胎辅助激活上,比较了胚胎辅助激活采用电激活和CHX化学激活对胚胎发育的影响。结果,卵龄40 h的大卵泡卵母细胞的囊胚发育率(19.3±1.7%,P 0.05)显著高于其它各组,42 h的小卵泡卵母细胞的囊胚率次之(11.0±1.3%);CHX化学辅助激活能提高胚胎的囊胚率,并且能够显著提高小卵泡胚胎的囊胚发育率(P 0.05),但大卵泡组胚胎囊胚率未见显著提高。实验四:以鉴定为转基因阳性的细胞为核供体,体外成熟的卵母细胞为胞质受体构建克隆胚胎,胚胎经体外培养后进行胚胎移植,共移植1889枚1-4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠(90%),7头妊娠足月(70%)分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1.1%(出生仔猪/移植胚胎)。对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87%。RT-PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat-1基因。 上述结果表明,利用SCNT可以有效的生产转基因猪,并且通过对供体细胞的转染、筛选及鉴定,可使转基因效率达到较高水平。转sFat-1基因克隆猪的诞生,为探索通过转基因手段改善猪肉品质奠定了坚实的基础。

【关键词】：
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：S828;Q819
【目录】：

摘要6-8

Summary8-13

第一章 文献综述13-32

1 转基因动物的制作与应用14-18

1.1 动物转基因技术研究进展14-16

1.2 动物转基因技术的应用16-17

1.3 转基因动物转基因存在的问题17-18

2 动物体细胞克隆技术18-27

2.1 动物克隆研究的简要回顾18

2.2 动物体细胞克隆技术的方法18-22

2.3 体细胞克隆猪及其应用22-24

2.4 转基因体细胞克隆技术24-25

2.5 动物克隆存在的问题25-27

3 多不饱和脂肪酸的功能及其基因工程研究进展27-31

3.1 PUFAs 概述27

3.2 ω-3 和ω-6 多不饱和脂肪酸的生理功能27-28

3.3 ω-6 和ω-3PUFAs 的生物合成28-29

3.4 ω-3 PUFAs 的基因工程合成的研究进展29-31

4 本研究的目的和意义31-32

4.1 研究目的31

4.2 研究意义31-32

第二章 试验部分32-58

1 大白猪胎儿成纤维细胞系建立32-38

前言32

1.1 材料与方法32-35

1.2 结果35-37

1.3 讨论37-38

2 sFat-1 基因转染大白猪胎儿成纤维细胞的研究38-44

前言38

2.1 材料与方法38-40

2.2 结果与分析40-42

2.3 讨论42-44

3 卵泡直径及辅助激活方式对克隆胚胎发育能力的影响44-52

前言44-45

3.1 材料与方法45-48

3.2 试验设计48

3.3 结果48-50

3.4 讨论50-52

4 转ω-3 脂肪酸去饱和酶基因sFat-1 克隆猪的生产52-58

前言52-53

4.1 材料与方法53-54

4.2 结果54-56

4.3 讨论56-58

第三章 结论58-59

参考文献59-65

致谢65-66

导师简介66-68

作者简历68

下载全文 更多同类文献

CAJ全文下载

(如何获取全文？ 欢迎：购买知网充值卡、在线充值、在线咨询)

CAJViewer阅读器支持CAJ、PDF文件格式

【引证文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 朱彦宾;利用同源重组载体和体细胞克隆技术生产MSTN基因和GGTA1基因敲除猪[D];甘肃农业大学;2011年

2 岳成鹤;GGTA1基因缺失五指山小型猪的制备[D];四川农业大学;2012年

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 崔文涛;单同领;李奎;;转基因猪的研究现状及应用前景[J];中国畜牧兽医;2007年04期

2 潘登科;陈红星;冯书堂;李奎;邓继先;;富含ω-3多不饱和脂肪酸克隆猪制备的关键技术研究[J];中国畜牧兽医;2007年05期

3 安晓荣,苟克勉,陈永福;体细胞克隆法生产绵羊转基因囊胚[J];科学通报;2001年10期

4 童佳;李宁;;转基因技术改良家畜的现状与趋势[J];中国农业科技导报;2007年04期

5 芮荣,鲍世明;小型猪实验化及其在胚胎生物工程领域的应用前景[J];四川农业大学学报;1999年02期

6 张德福;吴华莉;刘东;陈学进;陈莹;王凯;;猪体细胞克隆研究进展[J];上海农业学报;2007年03期

7 李雁;冯云;孙贻娟;;体细胞核移植后核重编程的影响因素[J];生命科学;2006年04期

8 陈晓宇,李青旺,胡建宏,王立强,张德福,卜书海,韩增胜;不同直径卵泡对猪卵母细胞体外成熟的影响[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2004年07期

9 潘登科;张运海;孙秀柱;李燕;吴常信;李宁;;供体细胞对猪体细胞克隆胚胎早期发育的影响[J];畜牧兽医学报;2006年04期

10 汪亚平,朱作言;基因靶位操作的原理与策略[J];遗传;1999年03期

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王轶敏;王新庄;李金辉;李义书;冯勋伟;;不同培养系统和传代方法对昆明白小鼠原始生殖细胞分离培养的影响[J];安徽农业科学;2008年12期

2 杨素芳;崔奎青;陈华海;韦精卫;韦兰锋;石德顺;;兔皮肤成纤维细胞的体外培养和NESTED-PCR支原体污染检测[J];安徽农业科学;2008年13期

3 刘萍;王海飞;汪劲能;陆艳凤;赵西彪;丁家桐;;Kiss-1基因在猪初情期下丘脑-垂体-卵巢轴中的定位研究[J];安徽农业科学;2008年15期

4 董社琴;李冰雯;;对节白蜡愈伤组织诱导的研究[J];安徽农业科学;2008年26期

5 王怡;管鹏飞;薛整风;成勇;;利用SRY基因鉴定山羊胎儿成纤维细胞的性别[J];安徽农业科学;2009年16期

6 毕琳;李键;王中乾;;小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展[J];安徽农业科学;2010年07期

7 周德存;;人幼儿心肌细胞体外培养的实验研究[J];安徽医学;2009年01期

8 朱晓峰,张荣华,彭柯萍;益骨胶囊含药血清对体外培养成骨细胞分泌IGF-Ⅰ的影响[J];安徽中医学院学报;2003年02期

9 李芳,朱怀仕,韩志强,陈刚,高庆蕾,贾平,张阿丽,奚玲,徐茜,廖国宁,王世宣,卢运萍,马丁;趋化因子受体及配体在卵巢癌细胞迁移中的作用[J];癌症;2005年01期

10 康永刚;廖云琼;;动物遗传繁育进展综述[J];现代农业科技;2008年08期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 王治国;袁耀明;;乳腺上皮细胞体外培养的研究进展[A];第三届中国奶牛发展大会论文集[C];2008年

2 郭勇;张西正;魏严;张永红;;新生大鼠心肌细胞的体外培养和工程化心肌组织的初步构建[A];第八届全国生物力学学术会议论文集[C];2006年

3 鲍世民;张德福;高静华;马胜成;何新桥;朱庭玉;;小型猪专用S-99颗粒饲料研制及其评估[A];中国实验动物学会青年科技协会第二届学术研讨会论文汇编[C];2001年

4 王林美;范琦;张波;叶博;赵振军;李树英;;柞蚕蛹卵巢原代细胞培养方法的研究[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集（3）[C];2009年

5 赵康峰;郭宝岚;张少平;孔建;治洪;刘景兰;张月;李毅民;;脑星型胶质细胞改进培养法[A];中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第六届全国学术会议、中国毒理学会遗传毒理专业委员会第五届全国学术会议、广东省预防医学会卫生毒理专业委员会学术会议、广东省环境诱变剂学会学术会议论文汇编[C];2008年

6 程树军;杜淑娟;邹志飞;;ESC与PHBV体外构建新型化妆品检测用皮肤的初步研究[A];2006年中国化妆品学术研讨会论文集[C];2006年

7 王春生;杜文敬;原璐;安铁洙;;绵羊高硫角蛋白启动子(B2C)表达活性研究[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2008年

8 梁洋;王春生;原璐;安铁洙;;转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞系的建立[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2008年

9 田长永;杨景晁;宋连喜;范强;庄岩;王立阁;鄂禄祥;柳志余;马泽芳;;辽宁绒山羊卵泡卵母细胞体外成熟的研究[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）[C];2010年

10 刘志涛;田树军;陈晓勇;张艳普;胡媛媛;温兵强;;幼畜卵母细胞体外发育能力研究进展[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）[C];2010年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 殷慧群;猪诱导性多潜能干细胞的建立[D];安徽农业大学;2010年

2 邵凌健;槐糖脂补料发酵及抗真菌、抗肿瘤活性的研究[D];山东大学;2010年

3 林源吉;K562及其耐药株K562/A02细胞膜蛋白与耐药机理的研究[D];浙江大学;2010年

4 杜瑞平;t10，c12-CLA对猪皮下和背最长肌脂肪沉积的差异性调控机理研究[D];内蒙古农业大学;2010年

5 李东杰;人脐带间充质干细胞促进创面愈合及体外诱导分化为表皮样细胞的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年

6 袁烁;化瘀消癥杀胚法对输卵管妊娠影响的临床与实验研究[D];广州中医药大学;2011年

7 梁洋;蜘蛛拖丝蛋白基因Spidroin1嵌合体小鼠的研究[D];东北林业大学;2011年

8 赵丽;三种重金属单抗的制备与抗体基因序列分析及其免疫检测方法的建立[D];内蒙古农业大学;2011年

9 赵高平;马体细胞核移植的研究[D];内蒙古农业大学;2011年

10 迟春萍;人铜锌超氧化物歧化酶在毕赤酵母中高表达及其中试工艺研究[D];吉林农业大学;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 朱银城;猪PGM1基因的序列、表达谱及多态性分析[D];华中农业大学;2010年

2 向安静;杜洛克×二花脸F2资源群体构建及其血液指标、免疫性状的测定和分析[D];华中农业大学;2010年

3 刘远;基于基因聚合策略选育高产仔数大白猪新品系的研究[D];华中农业大学;2010年

4 田振华;伴与不伴脂肪细胞共培养状态下IL-6对人单核/巨噬细胞增殖和功能的影响[D];南京医科大学;2009年

5 宋晓娣;笋用竹的组织培养研究[D];中南林业科技大学;2009年

6 刘建民;“复瓣玫瑰红”蔷薇的快繁技术研究[D];山东农业大学;2010年

7 罗学明;体细胞克隆繁育优秀种公猪技术的研究[D];甘肃农业大学;2010年

8 何淑玲;红芪高产配套栽培技术试验研究[D];甘肃农业大学;2010年

9 王云丹;阳和汤体外对成骨细胞的增殖作用及对破骨细胞的分化影响[D];湖南中医药大学;2010年

10 李永忠;壮骨镇痛胶囊含药和血浆对共育体系中破骨细胞活性及凋亡的影响的实验研究[D];湖南中医药大学;2010年

【同被引文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 ;Efficient production of omega-3 fatty acid desaturase (sFat-1)-transgenic pigs by somatic cell nuclear transfer[J];Science China(Life Sciences);2010年04期

2 ;Cloned pigs derived from somatic cell nuclear transferembryos cultured in vitro atlow oxygen tension[J];Chinese Science Bulletin;2006年07期

3 霍金龙,罗古月,张娟,张美,曾养志;新型实验动物——近交系猪的应用前景[J];中国牧业通讯;2004年04期

4 李蓓;俞慧清;朱采红;谢发展;陈建泉;成国祥;;敲除山羊胎儿成纤维细胞中的抗体重链基因[J];生物化学与生物物理进展;2008年08期

5 郑道山;冯冲;朱彦宾;龙川;冯书堂;潘登科;马文丽;;利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1基因[J];生物技术通讯;2011年04期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 潘登科;影响猪体细胞克隆胚胎发育能力的因素研究[D];中国农业大学;2005年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 罗学明;体细胞克隆繁育优秀种公猪技术的研究[D];甘肃农业大学;2010年

2 郑道山;利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1基因[D];南方医科大学;2011年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 吴光明,秦鹏春，谭景和，，张秋明;体外成熟猪卵母细胞的体外受精研究[J];东北农业大学学报;1996年02期

2 孙秀柱,李青旺,戴蕴平,程金华,龚国春,万荣,朱化彬;鲁西黄牛皮肤成纤维细胞分离与培养的研究[J];中国畜牧兽医;2004年12期

3 潘登科;牟玉莲;潘求真;万荣;刘吉;张莉;冯书堂;;不同类型的转基因细胞为核供体生产猪的转绿色荧光蛋白基因克隆胚胎[J];广西农业生物科学;2006年S1期

4 龚国春,戴蕴平,朱化彬,王海平,王莉莉,李荣,万荣,刘颖,李宁;供体细胞类型对体细胞克隆牛生产效率的影响[J];中国科学(C辑:生命科学);2004年03期

5 雷安民,高志敏,杨春荣,窦忠英;牛卵母细胞去核方法的研究[J];农业生物技术学报;2000年04期

6 施履吉;有关免疫学研究的两点设想[J];上海免疫学杂志;1997年06期

7 朱贵明;陈宏;周艳荣;卢建申;吴晓洁;陈红星;邓继先;;来源于线虫Caenorhabditis briggssae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的合成及其功能分析[J];生物工程学报;2006年05期

8 黄未未,汤雪明;转基因动物及其应用[J];生命科学;1998年04期

9 钱云,师蔚群,朱猛进,丁家桐,范必勤,YutakaFUKUI;卵泡内环境对猪卵泡卵体外成熟和发育的影响[J];生命科学研究;2001年02期

10 张德福,王英,陈茵,王凯,KarlSchellander,LinCailu;影响猪体细胞核移植重构胚体外发育的若干因素[J];实验生物学报;2003年01期

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 卢苏燕;中法利用新技术成功培育出体细胞克隆牛[J];四川畜牧兽医;2001年02期

2 ;科技[J];饲料广角;2007年23期

3 ;华南农业大学成功培育成粤首例体细胞克隆猪[J];广东农业科学;2008年06期

4 ;我国首个体细胞克隆牛胚胎移植中心成立[J];生物学通报;2004年09期

5 李拥军,薛慧文;哺乳动物体细胞克隆的研究与应用[J];甘肃农业大学学报;2003年03期

6 张德福;刘东;吴华丽;陈学进;王凯;陈莹;;猪作为异种器官移植供体的研究现状及发展趋势[J];猪业科学;2006年07期

7 ;中国克隆猪[J];青岛画报;2007年02期

8 ;世界首批亚种间体细胞克隆羊试验在上海获成功[J];当代畜牧;2005年12期

9 ;日本成功克隆已故"名牛"[J];畜牧兽医科技信息;2009年01期

10 ;转基因体细胞克隆奶山羊成功[J];湖南畜牧兽医;2002年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 黄永业;谭广云;谢万华;周炎;李栋;赖良学;逄大欣;欧阳红生;;规模化体细胞克隆猪生产的探讨[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年

2 朱姿英;杨小淦;卢晟盛;陆阳清;卢克焕;;猪体细胞克隆安全性评估及其产业化研究进展—以牛体细胞克隆产业化为鉴[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）[C];2010年

3 王晓丽;蒋建荣;徐莉萍;房慧伶;辛立江;石德顺;;一例体细胞克隆水牛肺、脾脏的组织结构观察[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2010年

4 宋少康;董雅娟;柏学进;牛召珊;朱孟芝;;体细胞克隆在肉牛育种上的研究进展及展望[A];2010中国牛业进展[C];2010年

5 张运海;刘亚;王维;陶勇;章孝荣;;体细胞克隆技术与安徽奶牛良种化[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年

6 刘丽梅;高飞;张鹏;安培培;宋光启;汤黎娜;唐博;李子义;;丁酸钠对猪体细胞克隆胚胎重编程及组蛋白乙酰化的影响[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年

7 雷安民;敬晓棋;严兴荣;胥涛;窦忠英;;体细胞克隆胚胎形态与质量相关性的研究[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年

8 胡军和;杨春荣;雷安民;敬晓棋;窦忠英;;体细胞克隆猪的研究进展(英文)[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年

9 苟克勉;安晓荣;陈永福;;体细胞克隆法生产绵羊转基因囊胚[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

10 刘凤军;王秀爱;庄益芬;叶屹峰;余翠月;洪志勇;陈梅芳;陈曦;谢旭东;张文昌;;微电极融合法对猪体细胞克隆胚胎融合激活及胚胎发育的影响[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）[C];2010年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 王柏涛　于永生 记者 于宁;[N];吉林日报;2011年

2 通讯员 乐良 成修 记者 诗星 野军;[N];烟台日报;2009年

3 林乐良　记者 操秀英;[N];科技日报;2009年

4 记者 王世焕;[N];新华每日电讯;2000年

5 周华、王立芳;[N];人民日报海外版;2005年

6 通讯员纪和春记者王建高;[N];科技日报;2002年

7 记者 张可喜;[N];新华每日电讯;2002年

8 本报记者 操秀英;[N];科技日报;2009年

9 记者　赵秋丽　特约记者　李志臣;[N];光明日报;2003年

10 记者范建通讯员才杰;[N];科技日报;2002年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 苏建民;牛体细胞克隆中异常重编程的分析及提高重编程效率的研究[D];西北农林科技大学;2012年

2 杨月春;延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的研究[D];延边大学;2010年

3 朱化彬;奶牛体外胚胎生产技术的研究[D];甘肃农业大学;2011年

4 屈娅;基于细胞电融合技术的体细胞重编程研究[D];第三军医大学;2012年

5 柳海星;转人血清白蛋白延边奶山羊—绵羊体细胞克隆胚胎生产体系的优化[D];延边大学;2013年

6 殷玉鹏;梅花鹿体细胞克隆胚胎构建及Ercc6l基因表达的研究[D];吉林大学;2012年

7 宋辉;山羊诱导性多能干细胞的研究[D];南京农业大学;2013年

8 吴侠;牛体外受精胚胎及克隆胚胎发育过程中组蛋白修饰表观遗传重编程的研究[D];内蒙古大学;2008年

9 高国龙;牛体细胞克隆中供体和受体细胞制备及重构胚构建的影响因素研究[D];华中农业大学;2007年

10 袁建龙;利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究[D];内蒙古大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 孙秀柱;鲁西黄牛体细胞克隆保种技术的研究[D];西北农林科技大学;2004年

2 张宇;延边黄牛体细胞克隆早期胚胎端粒酶活性的研究[D];延边大学;2010年

3 罗学明;体细胞克隆繁育优秀种公猪技术的研究[D];甘肃农业大学;2010年

4 黄雷;转基因体细胞克隆猪胚胎的制备[D];中国农业科学院;2011年

5 刘佳丽;黑熊体细胞培养及熊—牛体细胞克隆胚胎融合条件初探[D];延边大学;2010年

6 陈会兰;克隆猪部分组织病理学及生理生化指标分析[D];上海海洋大学;2012年

7 吕鑫;四倍体补偿法提高牛体细胞克隆效率的研究[D];甘肃农业大学;2013年

8 白力;去乙酰化酶抑制剂VPA对牛体细胞及克隆胚胎发育的影响[D];内蒙古大学;2012年

9 周娜汝;猪体细胞克隆胚胎着床前发育期间H3K27乙酰化重编程规律研究[D];安徽农业大学;2013年

10 王楠楠;曲古菌素A对延边黄牛体细胞形态、增殖特性及核移植重构胚胎的影响[D];延边大学;2012年

  本文关键词：转基因技术改良家畜的现状与趋势，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：111433