黄绿木霉内切葡聚糖酶Ⅱ基因的克隆与表达

发布时间：2017-10-29 23:45

  本文关键词：黄绿木霉内切葡聚糖酶Ⅱ基因的克隆与表达

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【摘要】：随着能源的匮乏,纤维素作为可再生资源,含量丰富,纤维素酶水解纤维素成小分子物质生产燃料乙醇是当前刻不容缓的问题。微生物降解纤维素为人类利用纤维素资源提供了可能。在地球上,真菌中的木霉属是分泌纤维素酶较多的微生物。本文以黄绿木霉(Trichoderma atroviride)AS3.3013菌株为实验材料,采用RT-PCR方法克隆出内切葡聚糖酶(EGⅡ)基因的cDNA序列,经测序为完整序列,在GenBank数据库登录号为KP098496,序列长度为1257bp,编码418个氨基酸,理论分子量为44.21k Da,理论等电点为4.96,信号肽为N端的21个氨基酸,是糖苷水解酶家族5的一种胞外酶。为了实现纤维素酶的高效表达,本研究构建了一种酿酒酵母高效重组表达载体YPIGH,将克隆到的EGⅡ基因连接到表达载体YPIGH和游离表达载体p YES2上,获得重组质粒YPIGH-EGⅡ和p YES2-EGⅡ,将重组质粒电转化入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVScⅠ中,测定内切葡聚糖酶酶活后,发现YPIGH-EGⅡ的酶活力比游离载体p YES2-EGⅡ的酶活提高了1.29倍。酵母转化子通过β-半乳糖诱导后,利用SDS-PAGE电泳分析,结果表明表达出目的蛋白,且大小基本符合理论值。研究采用实时荧光定量PCR的方法探究了黄绿木霉经不同底物诱导后的表达量和酿酒酵母转化子经β-半乳糖诱导后的表达量,研究表明:黄绿木霉在微晶纤维素(MCC)诱导下表达量最高,酿酒酵母转化子在第四天表达量最大。对重组酿酒酵母转子发酵条件进行优化,优化得到最佳产酶条件为:β-半乳糖含量为3%,YNB含量为0.84%,通氧量为100m L,培养温度为29℃时,重组酿酒酵母产酶量最大,最大产酶活性为116.10U/g。采用DNS法测定重组酶的酶活及酶动力学常数。结果显示:酶活最适温度为60℃,最适p H为5.0,在40-60℃范围内酶活稳定,p H在4.0-7.0之间具有较好的稳定性,Ag+对重组酶具有较强的激活作用,Co2+具有较强的抑制作用,蜜三糖为最佳底物。
【关键词】：黄绿木霉 内切葡聚糖酶 克隆 表达 酶学特性
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q936
【目录】：

• 摘要10-11
• 英文摘要11-12
• 1 前言12-20
• 1.1 纤维素和纤维素酶12-15
• 1.1.1 纤维素12-13
• 1.1.2 纤维素复合酶13-15
• 1.2 产生纤维素酶的生物15-16
• 1.2.1 真菌产生的纤维素酶15
• 1.2.2 细菌产生的纤维素酶15
• 1.2.3 放线菌产生的纤维素酶15-16
• 1.2.4 动物产生的纤维素酶16
• 1.3 国内外研究现状16-17
• 1.4 纤维素酶在工业上的应用17-18
• 1.4.1 纤维素酶应用在纺织业上17
• 1.4.2 纤维素酶应用在食品业上17
• 1.4.3 纤维素酶应用在饲料业上17-18
• 1.4.4 纤维素酶应用在生物能源上18
• 1.4.5 纤维素酶应用在造纸业上18
• 1.5 研究目的及意义18-19
• 1.6 本研究的技术路线19-20
• 2 材料与方法20-41
• 2.1 实验材料20-25
• 2.1.1 菌株与质粒20-22
• 2.1.2 药品及酶类22
• 2.1.3 试剂及配方22-25
• 2.1.4 实验仪器25
• 2.2 实验方法25-41
• 2.2.1 黄绿木霉的培养25
• 2.2.2 内切葡聚糖酶基因的克隆25-29
• 2.2.3 基因生物信息学分析29
• 2.2.4 酿酒酵母重组载体的构建29-32
• 2.2.5 酶切与连接32-34
• 2.2.6 酿酒酵母转化34-35
• 2.2.7 内切葡聚糖酶的诱导表达及分析35-36
• 2.2.8 重组酶的诱导表达及分析36
• 2.2.9 重组酶的酶学特性及动力学分析36-39
• 2.2.10 重组转化子发酵条件的优化39-41
• 3 结果与分析41-64
• 3.1 内切葡聚糖酶基因的克隆41-43
• 3.1.1 黄绿木霉总DNA和RNA的提取41
• 3.1.2 基因的克隆41-43
• 3.2 基因序列分析43-46
• 3.2.1 内切葡聚糖酶Ⅱ基因序列的分析43-44
• 3.2.2 内切葡聚糖酶蛋白质结构分析44-46
• 3.3 酿酒酵母整合载体YPIGH的构建46-48
• 3.3.1PCR扩增序列46-47
• 3.3.2 载体双酶切的鉴定47-48
• 3.4 重组表达载体的构建及转化48-50
• 3.4.1 构建游离表达质粒48-49
• 3.4.2 重组表达质粒的构建49
• 3.4.3 表达载体的转化49-50
• 3.4.4 酿酒酵母转化子的鉴定50
• 3.5 内切葡聚糖酶基因的诱导表达及分析50-52
• 3.5.1 黄绿木霉RNA提取50-51
• 3.5.2 黄绿木霉c DNA的验证51
• 3.5.3 基因的实时荧光定量PCR51-52
• 3.6 重组酶的诱导表达及分析52
• 3.7 酶学特性及动力学常数分析52-61
• 3.7.1 葡萄糖标准曲线52-53
• 3.7.2 重组蛋白的SDS-PAGE和水解圈分析53-54
• 3.7.3 重组内切葡聚糖酶的酶学特性分析54-56
• 3.7.4 酶促动力学分析56-61
• 3.8 内切葡聚糖酶的发酵条件优化61-64
• 3.8.1β-半乳糖含量对酶活性影响的分析61
• 3.8.2YNB含量对酶活性影响的分析61-62
• 3.8.3 通氧量对酶活性影响的分析62
• 3.8.4 温度对酶活性影响的分析62
• 3.8.5 重组酿酒酵母发酵条件的正交实验62-64
• 4 讨论64-67
• 4.1 内切葡聚糖酶基因的克隆64
• 4.1.1 基因供体的选择64
• 4.1.2 基因生物信息学分析64
• 4.2 内切葡聚糖酶基因的表达64-67
• 4.2.1 基因表达系统的选择64-65
• 4.2.2 制约外源基因表达的因素65
• 4.2.3 关于构建高效表达载体方面的讨论65-66
• 4.2.4 内切葡聚糖酶诱导表达的研究66
• 4.2.5 内切葡聚糖酶酶学特性分析66
• 4.2.6 内切葡聚糖酶发酵条件的优化66-67
• 5 结论67-68
• 致谢68-69
• 参考文献69-76
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文76

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