乳酸菌对空肠弯曲杆菌毒力基因表达的影响

发布时间：2017-10-30 10:44

  本文关键词：乳酸菌对空肠弯曲杆菌毒力基因表达的影响

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【摘要】：空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)为全球范围内一种重要的人畜共患食源性致病菌,广泛存在于各种动物体内,其中鸡是C.jejuni携带率最高的动物,C.jejuni可通过食物链传播,是腹泻最常见的病原菌之一。目前频繁使用的抗生素导致了致病菌耐药性问题日益严重。由于乳酸菌的安全无副作用,使用乳酸菌控制食品中的致病菌污染的方法正逐渐受到关注。本研究拟从菌种保藏库及鸡粪中筛选具有拮抗C.jejuni能力的乳酸菌,研究其肠道益生特性,并探讨其在体内外对C.jejuni毒力基因表达的影响及在体内对C.jejuni感染的预防作用,对C.jejuni的预防及人体健康有着重大意义。筛选体内外能有效拮抗C.jejuni及抑制其毒力基因表达的乳酸菌。以菌种保藏库中的112株乳酸菌和鸡粪中分离得到80株菌株为筛选来源,使用牛津杯抑菌实验初步筛选得到10株对C.jejuni生长具有较强抑制作用的乳酸菌;通过HT-29细胞的粘附能力检测,人工模拟胃肠液的耐受性考察,及对C.jejuni的flaA、ciaB、cdtB、pldA及cadF基因表达影响的探讨,进一步筛选获得罗伊氏乳杆菌X13。该菌株具有较强抑制C.jejuni生长的能力,粘附指数达到11.5个/细胞,经2 h人工胃肠液处理后活菌数无数量级上的变化,在体外对C.jejuni的ciaB及pldA基因表达的调控作用不显著,但能显著下调C.jejuni的flaA、cdtB及cadF基因的表达,其中对编码鞭毛蛋白的flaA基因表达的抑制作用最强。对罗伊氏乳杆菌X13无细胞提取物(Cell free spent medium,CFSM)中调控C.jejuni编码鞭毛蛋白的flaA基因表达的主要物质进行了初步研究。通过扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察发现X13纯培养无细胞提取物(CFSM)处理后C.jejuni的鞭毛长度显著低于对照组,表明X13 CFSM会抑制C.jejuni鞭毛合成。分别对X13 CFSM进行热处理、过氧化氢酶预处理、蛋白酶预处理发现其对flaA基因表达的调控作用与未处理组相比变化不显著,表明X13 CFSM调控flaA基因表达的物质具有热稳定性且不是过氧化氢及蛋白类物质;通过碱中和X13 CFSM发现其抑制flaA基因表达的能力显著下降,但中和后的X13 CFSM对flaA基因的表达与对照组相比仍有显著抑制作用,表明罗伊氏乳杆菌纯培养过程中产生的有机酸类物质对flaA基因的表达具有显著的抑制作用,但除有机酸外还存在其他抑制因素。采用人结肠癌上皮细胞系HT-29细胞考察罗伊氏乳杆菌X13对C.jejuni的毒力基因及HT-29细胞相关细胞因子表达的影响。结果显示罗伊氏乳杆菌X13能显著下调flaA、ciaB、cdtB及cadF的表达,而对pldA表达的调控作用不显著;检测HT-29细胞中细胞因子(IL-1β、IL-8、IL-10及TNF-α)的表达量发现罗伊氏乳杆菌X13能调控由于C.jejuni感染导致的HT-29细胞相关细胞因子的表达变化,使其向空白组水平恢复。通过小鼠模型研究罗伊氏乳杆菌X13在体内对C.jejuni毒力基因表达的影响,及对C.jejuni感染小鼠的预防作用。通过连续灌胃3周C.jejuni构建小鼠的C.jejuni感染模型,结果显示,C.jejuni在停止灌胃的2周内能持续定植于小鼠体内,感染C.jejuni后小鼠的体重增长减缓,脾脏指数减小,空肠、盲肠及结肠中细胞因子IL-1β、IL-8、IL-10及TNF-α的表达量与空白组差异显著,引发肠道炎症。提前1周用罗伊氏乳杆菌X13预防的小鼠各项指标均向空白组恢复,且其盲肠段毒力基因flaA、ciaB、cdtB的表达较C.jejuni感染组显著下调,而pldA、cadF基因表达差异不显著。综上,罗伊氏乳杆菌X13在小鼠体内能调控C.jejuni毒力基因的表达,且对C.jejuni感染引起的肠道炎症有缓解作用。
【关键词】：乳酸菌 调控 空肠弯曲杆菌 毒力基因
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS201.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 1 绪论9-18
• 1.1 空肠弯曲杆菌概述9
• 1.2 空肠弯曲杆菌的致病机制及毒力因子研究9-11
• 1.2.1 纤连结合蛋白10
• 1.2.2 鞭毛蛋白10
• 1.2.3 侵入抗原蛋白10
• 1.2.4 磷脂酶活性蛋白10-11
• 1.2.5 细胞致死性膨胀毒素11
• 1.3 空肠弯曲杆菌的感染及治疗11
• 1.4 乳酸菌拮抗空肠弯曲杆菌的研究11-12
• 1.5 乳酸菌干预病原菌感染的作用机制12-14
• 1.5.1 产生抗菌物质抑制病原菌的生长12-13
• 1.5.2 抑制病原菌的粘附13
• 1.5.3 调节肠粘膜物理屏障13
• 1.5.4 免疫调节作用13-14
• 1.6 乳酸菌对病原菌毒力基因表达的影响14
• 1.7 具有调控病原菌毒力基因表达的乳酸菌的筛选指标及方法研究14-16
• 1.7.1 抑菌能力15
• 1.7.2 粘附能力15
• 1.7.3 耐受胃酸及胆盐能力15
• 1.7.4 调控病原菌毒力基因表达15-16
• 1.8 立题背景与意义16
• 1.9 本课题研究的主要内容16-18
• 2 材料与方法18-28
• 2.1 实验材料18-20
• 2.1.1 实验菌株和细胞株18
• 2.1.2 实验动物18
• 2.1.3 实验材料与试剂18
• 2.1.4 主要试剂的配制18-19
• 2.1.5 主要仪器与设备19-20
• 2.2 实验方法20-28
• 2.2.1 鸡粪中乳酸菌的分离20
• 2.2.2 实验菌株的培养及其发酵上清液和菌悬液的制备20
• 2.2.3 具有拮抗空肠弯曲杆菌能力的乳酸菌的筛选及鉴定20-21
• 2.2.4 乳酸菌对细胞粘附能力的测定21-22
• 2.2.5 乳酸菌对人工胃肠液耐受能力的测定22
• 2.2.6 乳酸菌对空肠弯曲杆菌毒力因子表达的影响22-24
• 2.2.7 罗伊氏乳杆菌X13 CFSM调控flaA基因表达物质的初步研究24
• 2.2.8 罗伊氏乳杆菌X13 CFSM对HT-29细胞空肠弯曲杆菌感染的干预作用24-25
• 2.2.9 罗伊氏乳杆菌X13对小鼠空肠弯曲杆菌感染的预防作用25-27
• 2.2.10 数据处理和统计分析27-28
• 3 结果与讨论28-50
• 3.1 具有拮抗空肠弯曲杆菌及调控其毒力基因表达的乳酸菌的筛选28-39
• 3.1.1 空肠弯曲杆菌生长曲线28
• 3.1.2 具有拮抗空肠弯曲杆菌能力的乳酸菌的筛选及鉴定28-33
• 3.1.3 乳酸菌对细胞粘附能力的测定33-34
• 3.1.4 乳酸菌对人工胃肠液的耐受能力34-35
• 3.1.5 乳酸菌对空肠弯曲杆菌毒力因子表达的影响35-39
• 3.2 罗伊氏乳杆菌X13 CFSM调控flaA基因表达物质的初步研究39-43
• 3.2.1 罗伊氏乳杆菌X13 CFSM对空肠弯曲杆菌鞭毛合成的影响39-40
• 3.2.2 热处理对罗伊氏乳杆菌X13 CFSM调控flaA基因表达的影响40-41
• 3.2.3 过氧化氢酶处理对罗伊氏乳杆菌X13 CFSM调控flaA基因表达的影响41-42
• 3.2.4 蛋白酶处理对罗伊氏乳杆菌X13 CFSM调控flaA基因表达的影响42
• 3.2.5 调pH对罗伊氏乳杆菌X13 CFSM调控flaA基因表达的影响42-43
• 3.3 罗伊氏乳杆菌X13 CFSM对HT-29细胞感染空肠弯曲杆菌的干预作用43-46
• 3.3.1 空肠弯曲杆菌毒力因子表达情况43-44
• 3.3.2 细胞因子表达情况44-46
• 3.4 罗伊氏乳杆菌X13对小鼠感染空肠弯曲杆菌的预防作用46-50
• 3.4.1 空肠弯曲杆菌在小鼠体内的定植情况46
• 3.4.2 罗伊氏乳杆菌X13对感染空肠弯曲杆菌小鼠体重的影响46-47
• 3.4.3 罗伊氏乳杆菌X13对感染空肠弯曲杆菌小鼠脾脏指数的影响47
• 3.4.4 罗伊氏乳杆菌X13在小鼠体内对空肠弯曲杆菌毒力基因表达的影响47-48
• 3.4.5 罗伊氏乳杆菌X13对小鼠肠道组织中细胞因子的影响48-50
• 主要结论与展望50-52
• 致谢52-53
• 参考文献53-60
• 附录A：作者在攻读硕士学位期间发表的论文60-61
• 附录B：其他数据61

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