转基因抗虫水稻对生物多样性的影响

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    我国是农业人口大国，农业和粮食问题是制约国民经济的主要因素。水稻是我国最重要的粮食作物，每年的播种面积在2900～3300万公顷，占世界水稻种植总面积的20%；我国水稻总产量占世界稻谷产量的34%～36%，占我国粮食总产量的40%以上，其中杂交水稻的种植面积在55%以上，为我国水稻增产15%～20%。因此，水稻生产在维持我国粮食安全方面占有极其重要地位。

    虫害是农业生产上的一个重要制约因素。据联合国粮农组织统计，每年全球农作物因虫害造成的产量损失约为20%，用于害虫防治的农药达250万吨。我国每年由虫害造成的水稻产量损失占水稻总产量的5%以上，多达一千万吨，直接经济损失达到100多亿元人民币。水稻生产中的主要害虫为鳞翅目害虫，主要包括二化螟(Chilo suppressalis，Walker)化螟(Tryporyza incertulas,Walker)、稻纵卷叶螟(Chaphalocrocis medina)和大螟(Sesamia inferens，Walker)等，以及属于同翅目害虫的褐飞虱(Milaparvata lugens，Stal)、白背飞虱(Sogatella  furcifera，Horv6th)等，危害面积高达3亿亩次，严重影响了我国的水稻生产。由于长期施用农药，害虫已逐步对化学杀虫剂产生抗性;而且，随着化学农药种类的增多与滥用误用，导致稻米农药残留与环境污染问题日趋严重；同时，大量的农村青壮劳动力进城务工，造成水稻生产管理的劳动力缺乏。因此，我国水稻的虫害问题日益突出。

    培育推广具有抗虫能力的水稻新品种是解决我国水稻虫害问题的有效途径。由于在水稻及其近缘种中没有发现鳞翅目害虫抗性种质资源，难以通过常规育种技术培育抗虫水稻，因此采取转基因技术是培育抗鳞翅目害虫水稻品种的唯一途径。本文重点围绕转基因抗虫水稻，介绍了转基因抗虫水稻对生态环境和生物多样性的影响，阐述了转基因抗虫水稻对保护农业生态环境和生物多样性等方面的重要意义。

l  转基因抗虫水稻的研制

    转基因抗虫水稻是指通过转基因技术，将抗虫基因导入不同水稻品种，并获得稳定遗传、高效表达的优良抗虫水稻品系。目前转基因抗虫水稻研究主要集中在获得高效和广谱的抗虫基因、解决害虫产生耐受性、转基因沉默、转基因安全性以及去除选择标记等方面。

1.1  主要抗虫基因及作用机制

    当前国际上进行抗虫基因工程研究使用的抗虫基因包括苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、植物凝集素基因、α-淀粉酶抑制剂基因、胆固醇氧化酶基因等。其中，转基因抗虫水稻研究中普遍使用苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因。苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因(Bacillus thringiensis insecticidal crystal protein)简称Bt基因，来源于苏云金杆菌(Bacillus thringiensis)。在苏云金杆菌芽孢形成过程中可产生大量的伴胞晶体，由杀虫晶体蛋白组成，该蛋白对很多重要的农业害虫如鳞翅目、鞘翅目和双翅目昆虫均具有高度特异性的杀虫活性，能够在靶昆虫碱性肠道内溶解，经中肠蛋白酶的消化作用降解为具有活性的毒性肽，与中肠相应的膜受体特异性结合，形成跨膜离子通道或孔，破坏消化道细胞的离子渗透压平衡，造成细胞溶解，最终使昆虫停止进食而致死。Bt蛋白仅特异性结合昆虫中肠细胞，在哺乳动物中无结合位点，同时在动物体内可快速被消化降解，因此Bt基因被广泛用于防治重要的农业害虫，是目前世界上应用最为广泛的生物杀虫剂。目前转Bt杀虫蛋白基因的棉花、玉米已经在许多国家大面积地应用于生产，被认为是安全的。Bt类的cry1Ab、cry1Ac、cry1Ab/cry1Ac、cry1Ah、cry1C﹡和cry2A﹡等基因已用于转基因抗虫水稻的研究。2005年，伊朗已经正式批准转Bt杀虫蛋白基因水稻商品化生产，可以用于动物饲料及人类使用。我国于2010年颁发了转Bt杀虫蛋白融合基因水稻品系华恢1号及其杂交稻组合Bt汕优63在湖北省生产应用的安全证书。

    豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(Cowpea trypsin in hibitor，CpTI)是另一类常用的抗虫基因。CpTI来源于食用豇豆品种，主要存在于豇豆种子中，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的Bowman-Birk类型的双头蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶是害虫主要的蛋白消化酶(鳞翅目和部分鞘翅目害虫)，其中最为主要的是胰蛋白酶和类胰蛋白酶。CpTI被昆虫摄食后与昆虫肠道内蛋白消化酶的活性中心发生作用，并抑制其活性，同时产生厌食反馈信号，导致害虫减少进食，最终由于缺乏氨基酸而死亡。研究表明，CpTI比从其它豆类中提取的胰蛋白酶抑制剂具有更有效的抗虫特性，针对一些主要农业害虫起主要作用，具有广谱抗虫活性和昆虫不易对其产生耐受性的特点。为提高转基因植株的抗虫水平，Deng等采用了外源蛋白内质网亚细胞定位的策略，分别在CpTI基因的5′末端和3′末端分别添加了内质网定位的信号肽和内质网滞留信号KDEL的编码序列，获得了修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)。在转基因植株的细胞内，外源抗虫蛋白(cpTI)滞留在细胞的内质网及其衍生的蛋白体内，被双层脂质膜包裹，处于细胞的惰性环境中，避免了在细胞胞浆中快速降解,从而使其积累水平有了显著的提高，由此大幅度地提高了转基因植株的抗虫能力。

1.2  转基因抗虫水稻的研制策略

是目前可行的一项重要选择。使用双抗虫基因可大幅降低昆虫产生耐受性的几率，理论上昆虫产生耐受性的频率为两个单独基因产生耐受性频率的乘积。另一方面，外源基因在转基因植株中沉默是一个较为普遍的现象。利用核基质结合区(Matrix attachment region，MAR)序列克服外源基因失活，稳定和提高外源基因的表达水平，减少各转基因单株表达水平的差异，是近年发展起来的一个有效方法。将MAR序列构建到外源基因的两侧，使它们在转基因植物的染色质中形成独立的区域，这样可以避免外源基因表达的位置效应影响，降低外源基因失活的几率，从而提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平。此外，去除选择标记基因是人们普遍关注的一个重要问题，已成为国际上植物基因工程领域的主要趋势之一。目前，获得去选择标记基因转化植物的方法主要包括转座子介导法，位点特异性重组系统（如Cre/loxP系统)介导法、共转化方法以及由此发展的双T-DNA载体体系。利用双T-DNA载体体系克服了操作过程复杂、周期较长，以及获得无选择标记转基因植株的效率偏低等问题，通过后代分离就可以产生无选择标记基因的转基因植株。

1.3  转基因抗虫水稻及抗虫特性

    结合外源蛋白内质网定位策略、多抗虫机制策略、利用MAR序列提高外源基因稳定表达策略以及双T-DNA载体系统策略，中国科学院遗传与发育生物学研究所和福建省农业科学院合作研制了无选择标记高抗鳞翅目害虫的转双价抗虫基因cry1Ac/sck水稻品系及其杂交稻组合。通过Bt类的cry1Ac基因和修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂sck基因，两种抗虫机制完全不同的抗虫基因共同作用，大大降低了害虫产生耐受性的几率，有效扩展了转基因水稻的抗虫谱，显著增强了转基因水稻的抗虫性。多点大田抗虫性检测试验表明，转cry1Ac/sck双价抗虫基因水稻在田间表现出高抗二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫的能力(图1)（略）。2008年和2009年，转双价抗虫基因cry1Ac/sck水稻品系及其杂交稻组合：科丰8号、Ⅱ优科丰8号和闽优科丰8号在福建福州进行了生产性试验。结果显示：转基因抗虫水稻具有很强的抗虫性，生长期内完全可以不施农药：在正常喷施农药情况下，相同条件下种植的转基因抗虫水稻，包括Ⅱ优科丰8号、天优科丰8号、特优科丰8号、谷优科丰8号、全优科丰8号和闽优科丰8号，比对照Ⅱ优明86产量提高5%～19%。其中，Ⅱ优科丰8号的产量从对照的8517 kg/ha提高到9474 kg/ha，其他农艺性状无显著差异；而在不施农药的情况下，Ⅱ优科丰8号的产量比对照极显著增产，从对照的3451.5 kg/ha提高到9250.5 kg/ha；同时还发现，在不施加化学杀虫剂的情况下，转基因抗虫水稻Ⅱ优科丰8号的生长状态和受害情况依然优于施加化学杀虫剂的非转基因对照品种，从8 517 kg/ha增加到9250.5 kg/ha，比喷施农药的对照Ⅱ优明86产量增加8.6%，表现出了明显的增产效果。除目前研制的高抗二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟的转基因抗虫水稻外，新型的高抗鳞翅日害虫大螟的转基因抗虫水稻品种以及针对同翅目的褐飞虱、白背飞虱等害虫的转基因抗虫水稻也正在积极研制之中。

2  转基因抗虫水稻对生物多样性的影响

2.1  转基因抗虫水稻对稻田生态系统生物多样性的影响

    目前，水稻生产上控制虫害主要通过喷撒化学杀虫剂，我国水稻田间杀虫剂的使用量占水稻生产农药总用量的77.8%，带来巨额的防治费用；同时，长期施用农药造成了严重的环境污染和生态系统破坏。在我国的水稻主产区，长期施用广谱化学杀虫剂，在杀死害虫的同时也杀死了田间的益虫，极大的造成了对包括靶标害虫、非靶标害虫、害虫天敌等在内的稻田生态系统生物多样性的破坏，使得水稻生产越来越依赖农药的使用，造成了严重的恶性循环。种植转基因抗虫水稻，可大幅度减少化学杀虫剂的施用量。与大量施用化学杀虫剂相比，转基因抗虫水稻对稻田生态系统生物多样性的影响显著减小。目前转基因抗虫水稻的环境安全试验和生产性试验研究结果表明，转Bt基因和CpTI基因的转基因抗虫水稻，能够有效杀死稻田中的靶标生物，而对稻田中非靶标生物(包括非靶标害虫、天敌及节肢动物等)的生物多样性无不良影响。

    刘雨芳等研究了转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻及其杂交后代对水稻害虫群落的影响。结果表明，转基因抗虫水稻及其杂交后代对稻纵卷叶螟具有极强的抗性，而生长全期的调查结果显示，与对照材料相比，转基因抗虫水稻对水稻害虫群落的各类参数均无显著影响，转基因水稻田与对照田在主要害虫物种组成上相似性较高。靶标害虫种群数量的降低，并未对水稻害虫群落的组成与结构产生明显的影响，也没有引起优势种成分的变化。转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻及其杂交后代对稻田寄生蜂群落的影响及生态安全性的研究结果表明，在群落水平上，转基因抗虫水稻及杂交稻对稻田寄生蜂的物种丰富度、多样性指数、均匀性指数和优势集中性指数的总体情况与时间动态以及个体总数无明显负面影响，仅会降低以靶标害虫稻纵卷叶螟为寄主的寄生蜂功能团的个体数量，从0.043减少为0.039。

    白耀宇等研究发现，转Bt cry1ab基因水稻花粉对稻田生态系统的重要天敌中华草蛉成虫产卵前期、产卵量、产卵天数以及成虫寿命等参数无显著影响。在人工饲料中花粉比例由20%上升到80%后，转基因水稻与对照处理的草蛉各生态参数均发生变化，但同一比例下转基因与对照间的差异不显著（P>0.05)。刘志诚等在对转cry1Ab/cry1Ac融合基因的Bt抗虫水稻和化学杀虫剂对稻田节肢动物群落比较分析的结果表明，Bt稻田群落结构主要参数，包括物种(科)丰富度、Shannon-Wiener多样性指数、均匀性指数、优势集中性指数分别为41、2.62、0.49和0.29，对照田各为36、2.75、0.53和0.24，而化防田则为30、1.80、0.36和0.49。与对照田相比，Bt稻田的节肢动物的生物多样性各类特征指标在大多情况下均无显著差异，两者间群落结构相似性较高，Bt水稻对稻田节肢动物群落无明显负效应；而施用化学杀虫剂的稻田节肢动物群落特征指标与对照田相比，具有显著的差异，群落结构相似性也较低。Bt水稻对稻田节肢动物群落的影响明显低于化学杀虫剂。

转修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂sck基因抗虫水稻的环境安全性试验结果也显示：抗虫转基因水稻对非靶标害虫、天敌、稻田节肢动物以至整个稻田生态系统有正而影响(表1略)。与对照稻田相比，转基因抗虫水稻稻田靶标害虫虫口密度显著降低，这表明抗虫转基因水稻可有效控制螟虫种群的发展。与对照稻田相比，转基因抗虫水稻稻田寄生性昆虫的密度大幅降低，中性昆虫和捕食性天敌的密度显著增加。寄生性昆虫密度的降低，与转基因抗虫水稻稻田中螟虫虫口密度的大幅下降有着密切的关系：而转基因抗虫水稻稻田适宜的微生态环境为中性昆虫提供了适宜的栖息地，促使中性昆虫及相应的捕食性天敌(捕食性昆虫和蜘蛛等)大量繁衍。同时试验还发现，种植转基因抗虫水稻植株不需施用杀虫剂，其稻田生态环境得到改善，可见到在种植非转基因水稻（施用杀虫剂)稻田中多年未见的小鱼、小虾、蝌蚪等。

    目前的研究表明，转基因抗虫水稻对稻田生态系统和生物多样性的影响是正面的，然而，其长期影响还有待于进一步研究。转基因抗虫棉由于化学杀虫剂施用量的减少所引起的对非靶标害虫的生态效应值得关注与借鉴相关防治经验。

2.2  转基因抗虫水稻外源基因飘流的影响

    转基因植物基因飘流是指外源基因通过花粉扩散、授精杂交向同种植物及近缘野生种转移的过程。

    目前研究表明，抗虫转基因水稻向非转基因水稻的基因飘流频率很低。戎俊等在研究转双价抗虫基因(Bt/CpTI)水稻中的外源转基因通过花粉介导向非转基因水稻品种基因飘流实验中发现，在采用转基因与非转基因水稻品种近距离相邻种植的情况下，由转基因水稻向对应的非转基因水稻品种基因飘流的频率较低(0.275%～0.832%)。转基因水稻对非转基因亲本对照材料的基因飘流频率随栽种间隔距离的增大而骤减：从间隔0.2 m时的0.28%到间隔6.2m时的0.01%（图2略）。花粉介导的转基因水稻基因飘流频率能够在较短隔离距离下保持极低水平，低于目前对转基因生物及产品控制最严格的欧盟制定的偶然混杂的阈值水平0.9%的标准。已有研究表明，列于严格白花授粉的水稻而言，通过一定的隔离措施，能有效降低水稻的基因飘流。

    田间试验结合模型分析显示，转基因水稻向普通野生稻及近缘杂草稻的基因飘流频率要高于水稻品种间的基因飘流频率，能够通过每世代持续飘流(re-current gene flow)获得积累效应。目前主要通过采取足够隔离距离来有效对野生稻等自然资源进行环境保护。Wang等研究发现，栽培稻(Oryza sativa)向普通野生稻(O.rufipogon)以及稗草(Echinochloa crusgalli)的基因飘流频率从0～lm时的1l%～18%骤减至250 m时的0.01%；同时，稗草与含有转抗除草剂bar基因的水稻连续种植5年以上，也没有发现转基因渗入到稗草之中。除采取隔离措施外，目前已在开发其他限控水稻基因飘流的技术，例如通过RNA干扰技术，抑制水稻中苯达松解毒酶基因CYP81A6的表达，从而控制转草甘膦抗性基因EPSPS水稻对除草剂苯达松的敏感性，一旦发生基因飘流，可通过喷洒苯达松选择性地对杂草稻进行有效控制。

3  结语与展望

    种植转基因抗虫水稻能够大量减少农药的施用量，降低对田间益虫的影响，有利于稻田生态系统的动态平衡，同时能够减轻农药残留物对于自然生态环境的污染和危害；另外，转基因抗虫水稻还能够降低相关劳动力投入，从而节省生产成本。因此，转基因抗虫水稻的应用必将产生巨大的经济、生态和社会效益。今后应加紧研制和培育高抗大螟、稻飞虱等水稻害虫的新型安全转基因抗虫水稻新品种，使之在保障我国粮食安全及农业的可持续发展中发挥更大的作用。

    与此同时，还应进一步研究转基因逃逸带来的环境生物安全影响，加强对生态地点的详细了解，对野生相关种的生态调查。采取空间、物理和生物隔离的方法来控制转基因作物的基因飘流，并研制一系列控制转基因作物基因飘流的新技术。采取质体转化技术使外源基因在质体表达体系中高效表达并具有母系遗传的特点，利用外源基因删除技术（Gene-Deletor)可将转基因植物花粉和种子中的外源基因全部清除。这些技术的成熟和广泛应用将会为有效解决转基因植物基因飘流等潜在的环境生物安全问题提供新的途径。

    对于单一的作物生产中的虫害防治问题，单项技术并不能达到人类的预期目标，转基因技术只是人类控制虫害的关键方式之一，如果在利用转基因抗虫水稻的同时，辅以生物防治，如使用害虫天敌赤眼蜂等，以及在此过程中利用性激素、黑光灯诱捕，并结合适宜的耕作制度，我们相信，通过这样的综合治理将会对农作物的虫害起到更好的防治效果。

    单一的技术往往难以解决所有问题。对于一个种植各类农作物的综合农业生态系统，需考虑地区情况，，对虫害进行综合治理，这将需要昆虫学、生态学、植物保护、生物技术育种，以及地方农业主管部门和农户等多学科、多方面的联合统一协调治理，才能最大限度的防治虫害，并使农业生态环境进一步向良性发展。随着生物多样性显著提高，天敌控制害虫的能力进一步加强，将更大幅度地减少农药的用量，实现真正的绿色农业。

    作者单位：（1.中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室，北京  100101;2.中国科学院遗传与发育生物学研究所国家植物基因研究中心(北京)，北京 100101）

    文章采集：caisy

    注明：转基因生物新品种培育重大专项(编号：2008ZX08001-001-001;2008ZX08012-002)和国家重点基础研究发展计划项目(973计划)（编号：2007CBl0920l）资助。

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