鸭IFNα-IFNγ、IFNα-IL18基因的融合表达及其生物学活性研究

发布时间：2017-11-05 19:37

  本文关键词：鸭IFNα-IFNγ、IFNα-IL18基因的融合表达及其生物学活性研究

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【摘要】：干扰素(interferon,IFN)是一类在同种细胞上具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学功能的细胞因子。国际干扰素命名委员会根据干扰素的抗原特性和分子结构的差异,将干扰素分为3个型。α干扰素(IFN-α)属Ⅰ型干扰素,主要参与机体抗病毒、抗肿瘤和免疫调节过程。γ干扰素(IFN-γ)属于Ⅱ型干扰素,IFN-γ可诱导病毒感染的细胞表达病毒抗原,增加免疫系统识别和杀伤感染细胞的能力,还可作为免疫佐剂参与机体的免疫反应,其抗病毒作用弱于Ⅰ型干扰素。白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)是由单核巨噬细胞分泌,IL-18能够诱导IFN-γ基因表达,也可诱导诸如TNF-α、IL-2及GM-CSF等多种细胞因子的产生和表达,在细胞免疫过程中发挥着重要作用。以往关于鸭干扰素与白细胞介素的研究,主要是针对单个干扰素或白介素,将鸭IFN-α、IFN-γ和IFN-α、IL-18进行串联表达后,其联合抗病毒的效果尚不清楚。本研究应用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapextension,SOE-PCR)的方法,分别将鸭IFN-α、IFN-γ及IFN-α、IL-18基因进行融合,利用BL21原核表达系统进行表达,分别在体内和体外检测融合蛋白的生物学活性,并与单个鸭IFN-α、IFN-γ和IL-18重组蛋白进行生物学活性比较,目的在于研究出易于生产,成本低,活性高,具有叠加抗病毒功能的重组复合抗病毒制剂。具体分为4个部分:1.本研究参照GenBank上发表的鸭IFN-α、IFN-γ和IL-18基因序列分别设计了3对引物,以抽提的鸭外周血淋巴细胞DNA为模板,分别扩增出去除信号肽后的目的基因。应用SOE-PCR的方法分别将鸭IFN-α、IFN-γ及IFN-α、IL-18基因进行融合,然后,将各基因连接到pET-32a(+)原核表达载体上,构建出鸭IFN-α、IFN-γ、IL-18、IFNα-IFNγ和IFNα-IL18基因的原核表达载体。2.将各重组质粒转化至BL21原核表达系统中进行原核表达。将存在于包涵体中的表达蛋白用尿素变性后,使用镍亲和层析的方法纯化蛋白,后利用梯度透析法进行复性,并进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。3.采用微量细胞病变抑制法在VSV(水泡性口炎病毒)/DEF、AIV(禽流感病毒)/DEF及DPV(鸭瘟病毒)/DEF系统上检测原核表达蛋白rDuIFNα-DuIFNγ和rDuIFNα-DuIL18的抗病毒活性,同时以rDuIFN-α、rDuIFN-γ和rDuIL-18作为对照。结果表明:rDuIFNα-DuIFNγ和rDuIFNα-DuIL18蛋白均有显著的抗VSV、AIV和DPV活性,在DEF上,其抗病毒活性明显优于单一rDuIFN-α、rDuIFN-γ和rDu IL-18重组蛋白,达到105~108 U/mg,其中,融合蛋白rDuIFNα-DuIFNγ的抗病毒活性高于rDuIFNα-DuIL18。单一重组蛋白rDuIFN-α、rDuIFN-γ和rDuIL-18中,rDuIFN-α的活性最高,达到104~105 U/mg,约为rDuIFN-γ的2~10倍,rDuIL-18的抗病毒活性最低。4.分别检测各重组蛋白在北京鸭体内抗AIV和DPV作用。结果表明,融合蛋白rDuIFNα-DuIFNγ具有较好的抗病毒效果,可有效减少排毒,对AIV和DPV感染动物的保护率分别为100%和90%,而单一重组蛋白对感染动物的保护率多在90%以下,证明rDuIFNα-DuIFNγ可有效提高攻毒保护率,其抗病毒作用优于单个蛋白。在北京鸭上检测重组蛋白rDuIFN-α、rDuIL-18和rDuIFNα-DuIL18对AIV灭活疫苗的免疫增强作用,发现重组蛋白rDuIL-18和rDuIFNα-DuIL18具有一定的免疫增强作用,对免疫后的抗体水平和攻毒保护率有一定的提高作用。
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S834

【参考文献】

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本文编号：1145597