褶纹冠蚌Kunitz型和Serpin B型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆与表达

发布时间：2017-11-10 06:28

  本文关键词：褶纹冠蚌Kunitz型和Serpin B型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆与表达

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【摘要】：本文从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)中克隆到了丝氨酸蛋白酶抑制剂Kunitz基因和Serpin B基因的c DNA全长序列,并对其同源性和三级结构进行了分析,采用定量PCR方法检测这2个基因在褶纹冠蚌肝胰腺、血细胞、闭壳肌、鳃和外套膜组织中的相对表达量,利用PBS、革兰氏阴性菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和脂多糖(LPS)刺激诱导蚌后,检测这2个基因在蚌的血细胞和肝胰腺组织中的表达变化。以质粒pet-32为载体用基因重组技术构建p ET32-Kunitz原核表达载体,利用大肠杆菌表达系统进行表达并纯化出纯度较高的Kunitz的重组蛋白。褶纹冠蚌丝氨酸蛋白酶抑制剂Kunitz型基因的c DNA全长序列为1378bp,其中5’UTR有128 bp;3’UTR有482 bp,含有一个poly A尾;开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长度为768 bp,编码的蛋白质含255个氨基酸。该蛋白序列N端有1个信号肽序列,包含17个氨基酸结构。成熟肽由238个氨基酸组成。该蛋白理论等电点(PI)为8.32,相对分子量为28.7 k Da。其序列与茅竹蛏(Solen grandis)高度相似,为98%。Kunitz型有4个保守序列,空间结构含有6个β折叠和3个ɑ-螺旋。Kunitz型基因在血细胞、肝胰腺、鳃、闭壳肌和外套膜都检测到了表达量,其中在外套膜的表达量是最低的,转录水平最高的组织是血细胞,其次是肝胰腺。嗜水气单胞菌刺激后的实验组褶纹冠蚌,与PBS对照组相比,血细胞和肝胰脏的表达量都在12 h达到最大值,肝胰脏在48 h左右恢复到0 h的表达水平,血细胞在48 h表达量仍然维持在较高水平。在脂多糖刺激组中,肝胰脏和血细胞的mRNA转录水平也是在12 h达到最高值,之后回落,但肝胰脏的增幅更明显。通过质粒p ET-32与目的基因构建重组质粒p ET32-Kunitz在诱导破碎后发现其以可溶性蛋白主要存在于上清中。Kunitz的可溶性蛋白经纯化获得了纯度较高的重组p ET32-Kunitz,经分析确认所得重组蛋白在40 k Da左右,与预测的蛋白大小一致。褶纹冠蚌Serpin B cDNA全长为1565 bp,包括3’端非翻译区362 bp,5’非编码区(UTR)长21 bp,含有典型的腺苷酸信号序列AATAA和Poly A尾。该基因序列包含一个编码393个氨基酸的开放阅读框(ORF),编码区1182 bp,预测蛋白质相对分子量为44.2 k Da,等电点为6.57。与牡蛎(Crassostrea gigas)的同源性最高,为47%。在氨基酸25-391的位置为SERPIN结构域,该蛋白为Serpins超家族蛋白。Serpin B型基因在血细胞、肝胰腺、鳃、闭壳肌和外套膜都检测到了表达量,其在鳃中的转录水平最低,在血细胞中转录水平最高,约为鳃的9.92倍,其次是肝胰脏,约为鳃的6.85倍。嗜水气单胞菌刺激褶纹冠蚌后,与PBS对照组相比,血细胞和肝胰脏的表达量都在6~24 h增长趋势趋于缓和,在48 h达到最大,尤以肝胰脏表现敏感。在脂多糖刺激组中,与PBS对照组相比,肝胰脏在12 h转录水平达到最高,之后在48 h回落到0 h的水平,血液的表达水平0~12 h变化不显著,在24h达到最高值。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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本文编号：1165468