青海弧菌荧光素酶基因异源表达优化及其转座载体构建

发布时间：2017-11-17 10:05

  本文关键词：青海弧菌荧光素酶基因异源表达优化及其转座载体构建

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【摘要】：荧光素酶是发光菌在生物发光过程中起催化作用的关键因子,由还原性黄素单核甘酸(FMNH2)、氧气、脂肪醛发生生化反应,生成脂肪酸、水和490 nm的蓝绿光。当前成像技术和以荧光素酶为基础的生物发光菌株结合的方法提供了一个灵敏、简单而且非致病性的检测手段,荧光素酶的研究成为科研工作中的一个热点。生物发光标记以其可视化、便捷、快速、灵敏,可用于活体研究等诸多优点越来越多地应用于科学研究中。本次研究对构建成功的带有青海弧菌荧光素酶基因luxAB的重组质粒大肠杆菌Top10表达条件优化,为进一步在益生菌等食品微生物中的应用奠定了基础,而且为后续酶学性质的研究和酶的分子修饰提供参考。试验后半部分构建的带有青海弧菌荧光素酶基因luxAB的转座载体的重组菌株Z10,利用转座发生后荧光素酶可以稳定高效表达这一特点,为发光菌对环境、食品等领域的检测提供了一个原始材料。具体研究结果如下:(1)核酸电泳验证和蛋白表达验证表明,重组质粒已经导入大肠杆菌并且荧光素酶已经表达。(2)表达条件进行优化结果,单因素结果表明:培养基初始pH为6.0,癸醛终浓度为1.25‰(v/v),接种量为1%,IPTG浓度为0.1 mmol/L,装液量为50 mL/150mL,温度为37℃重组菌的发光度最大,即荧光素酶表达量最大。(3)正交试验表明:构建的重组发光性细菌发光影响程度从大到小依次是接种量、温度、初始pH、IPTG诱导浓度,而且pH为6.0,IPTG浓度为0.08 mmol/L,接种量为1.2%,温度为36℃表达情况最好,发光度达到1262.7,并且正交试验结果与单因素最优组合结果相比,发光强度更大,说明正交试验的条件是荧光素酶表达的最优条件。(4)转座载体的酶切验证和测序表明,已经成功构建带有青海弧菌荧光素酶基因的转座载体,并将其保存于大肠杆菌Top10。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS201.3

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本文编号：1195624