耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及酶学性质的研究

发布时间：2017-11-20 22:20

  本文关键词：耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及酶学性质的研究

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【摘要】：本论文主要针对“耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及酶学性质”开展系统深入地研究。耐高温淀粉酶在高温条件仍具有很高的活性,可满足工业高温生产的需求,因此,被广泛应用于食品、纺织等行业。耐高温淀粉酶是食品生产中重要的酶制剂之一。工业上一般采用微生物发酵的方法生产耐高温淀粉酶。而枯草芽孢杆菌因具有生长环境要求简单、适应环境能力强、易于培养、无致病性等优点,常被用做食品工业上耐高温淀粉酶的生产发酵菌株。从自然界中获得的耐高温淀粉酶的活性较低,不能满足生产要求。DNA shuffling体外重组技术可以在短时间内改变基因序列,通过筛选可获得高酶活的菌株;通过对DNAshuffling的条件进行优化,并对突变株进行初步筛选,得到两株疑似突变的菌株。具有宝贵的收藏潜力与利用价值。构建重组枯草芽孢杆菌B.subtilisWB600/p0613。耐高温淀粉酶0613基因与穿梭质粒plip连接构建重组载体p0613。p0613转化至大肠杆菌E.Coli MC1061,构建E.Coli MC1061/p0613,经验证E.Coli MC1061/p0613能够表达0613酶。p0613载体转化至枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600,构建B.subtilisWB600/p0613,经验证B.subtilis WB600/p0613能够表达0613酶。酶学性质研究,热处理后的酶液经Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化,获得纯酶液。蛋白分子量为73.1kDa,蛋白浓度为0.3863±0.0613mg/ml,酶活为6.853U/mLl。75-100热处理1h后,相对酶活为93%-32%。pH3.5-7.0的缓冲液与酶混合,37 12h,相对活性范围60%-93%。EDTA及Al~(3+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)对酶有激活作用,Ca~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Mn~(2+)对酶有抑制作用。酒精浓度为1%时,酶活下降明显。耐高温淀粉酶基因0613与1458被DNase水解成50-200bp的小片段。经过无引物与有引物扩增后获得突变基因。突变基因与不同的质粒载体pTKNd6×H、p6×HTKNd连接构建mutant0F0R、mutant1F1R、mutant0R1F载体,转化至E.Coli MC1061。利用DNS法筛选高酶活的菌株。本研究对DNA shuffling条件进行优化,为获得性状优良的菌株奠定了良好的基础。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TQ925.1

【参考文献】

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本文编号：1208721