苦荞芦丁降解酶基因启动子的克隆及功能分析

发布时间：2017-11-20 22:27

  本文关键词：苦荞芦丁降解酶基因启动子的克隆及功能分析

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【摘要】：芦丁作为苦荞(Fagopyrum tartaricum)中重要的黄酮类化合物,具有抗高血糖、抗高血压、抗氧化的性质。芦丁降解酶(Rutin degrading enzyme, RDE)是芦丁分解代谢中的关键酶之一,对芦丁产生特异的降解作用,造成终端产品中芦丁含量显著降低。本研究通过克隆芦丁降解酶基因启动子序列,利用生物信息学方法预测其上顺式作用元件,并对其进行5｀端截短,原生质体瞬时转化以及对外源信号物质的响应规律进行分析,进一步揭示芦丁降解酶基因的调控机制,为揭示其生物学功能及对苦荞次生代谢物的调控机制奠定了基础。本研究得到的主要结论有：(1)苦荞叶肉细胞原生质体的制备条件为：以苦荞叶片为材料,在1.5%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.5 mol/L mannitol+20 mmol/L MES+20 mmol/L KCl+10 mmol/L CaCl2+0.1% BSA酶解液中,黑暗处理4 h,90×g离心速度收集原生质体,可以获得大量、细胞膜完整、高活力的原生质体,原生质体的产量为6×106个儋,活力达到90%以上。(2)通过染色体步移技术克隆得到了苦荞FtRDE启动子,长度为1907 bp。利用生物信息学手段进行分析,发现FtRDE启动子上的基本元件有：TATA-box (-60 bp)、CAAT-box (-131 bp)和转录起始位点(-30 bp),同时,还具有1个茉莉酸甲酯响应元件(TGACG-motif,-443 bp)、3个脱落酸响应元件(ABRE,-438 bp、-535 bp、-1145 bp)和1个种子特异性调节元件(RY repeat,-94 bp)。(3)通过对苦荞FtRDE启动子进行5｀端截短,构建5个FtRDE截短启动子重组载体FtRDEPR1、FtRDEPR2、FtRDEPR3、FtRDEPR4和FtRDEPR5,并将其转入苦荞叶肉细胞原生质体中进行瞬时表达分析,发现在FtRDE启动子上-1077 bp至-1829 bp区域存在抑制其转录的顺式作用元件。并通过实时定量分析发现,外源信号物质MeJA和ABA均能上调FtRDE的表达量,进一步证明了FtRDE启动子上存在响应MeJA和ABA的顺式作用元件。通过半定量分析发现,在苦荞灌浆期,FtRDE在种子中表达量最高,进一步证明了FtRDE启动子上存在种子特异性元件的可靠性。(4)分别将FtRDE正向、反向干扰片段和过表达片段插入到pTCK303载体中,成功构建苦荞FtRDE干扰载体(FtRDEi-pTCK303)和过表达载体(FtRDEm-pTCK303),为深入研究芦丁降解酶的生物学功能奠定了基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2

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本文编号：1208752