hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

发布时间：2017-11-25 10:06

  本文关键词：hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

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【摘要】：目的:构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。方法:以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1 770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。结果:经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68 860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。结论:成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。
【作者单位】： 遵义医学院珠海校区生物化学教研室;遵义医学院生物化学教研室;
【基金】：贵州省科技厅社会发展攻关项目资助课题[黔科合SY字(2012)3091)] 遵义医学院青年科研启动基金资助课题(F-501)
【分类号】：Q78;R378.21
【正文快照】： 糖酶(sucrase-isomaltase,SI)复合体均属于α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase),人体当中的这4种α-葡萄糖苷酶均具有水解α-1,4糖苷键的作用,其中SI复合体的N端还具有水解α-1,6糖苷键的作用,SI复合体在肠道中的胰蛋白酶的作用下分解为蔗糖酶和异麦芽糖酶(isomaltase,ISO)而发挥作

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