禽致病性大肠杆菌E058株compT、pompT基因突变株的构建及其致病性评价

发布时间：2017-12-01 19:06

  本文关键词：禽致病性大肠杆菌E058株compT、pompT基因突变株的构建及其致病性评价

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【摘要】：禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起禽类的一种复杂的多系统综合症的总称,其特征是多器官病变,并以气囊炎、心包炎、肝周炎、腹膜炎最为典型。该病给世界养禽业造成了重大的经济损失,同时越来越多的证据表明APEC具有人兽共患的潜能。大肠杆菌外膜蛋白T (Outer membrane protein T, OmpT)定位于大肠杆菌外膜,属于革兰氏阴性菌omptin外膜蛋白家族。APEC中OmpT由位于染色质ompT基因(compT)编码。基因序列比对发现位于pAPEC-O2-ColV中的质粒中的ompT基因(pompT)与其同源性为79%。且有研究表明：compT和pompT两个基因在禽致病性大肠杆菌分离株中均有很高的检出率,分别是62.5%和78.5%。关于ompT在禽大肠杆菌病发病机制中的作用还不清楚,两个ompT是否都参与介导菌体侵袭及相关毒力机制还有待研究。本研究旨在探讨compT和pompT基因与APEC致病性间的关系,了解APECcompT和pompT两个基因突变株的生物学特性,为了解APEC的致病机理和寻找特异性防治措施奠定基础。为了研究compT和pompT基因与APEC致病性间的关系,通过对OmpT活性部位预测分析,以APEC E058为亲本株,构建了缺失不同大小ORF的突变株和活性位点的点突变株。除了利用本实验室已经构建好的E058△50%pormpT::cat、E058△100%pompT::cat缺失株外,本研究运用λ RED同源重组的方法构建了E058△50%compT::cat、 E058△100%coompT::c at缺失株。PCR扩增带酶切位点的compT基因并插入到pMD(?)19-T载体,反向扩增pMD-T-compT片段后与cat抗性片段酶切、连接、转化,构建出带Cat抗性的重组质粒pMD-T-compT::cat。PCR扩增同源重组片段50%compT-cat,直接用带同源片段引物扩增同源重组片段100%'ocompT-cat并电转化入带有pKD46质粒的亲本株E058中,运用同源重组的方法,筛选出E058△50%compT::cat、E058A100%compT::cat缺失株。选择两个OmpT的活性相关位点97和99位,运用CRISPR/Cas方法构建了点突变株E058compTD97H、E058compTS99I、E058pompTD97H、E058pompTS99I。通过用E058△50%compT、E058△50%pompT无抗突变株作为亲本株,构建pTargetF-FRT重组质粒,利用OverLap PCR扩增引入点突变的同源重组片段compTD97H、compTS99I、pompTD97H、 pompTS99I,电转化入带有pCas质粒的亲本株中,测序筛选出E058compTD97H、 E058compTS99I、E058pompTD97H、E058pompTS99I点突变株。生长曲线的测定结果显示缺失突变株、点突变株和野生株E058在生长速度上没有显著差异。鱼精蛋白抑制试验结果显示E058△50%pompT::cat、E058△100%pompT::cat、E058pompTD97H、E058pompTS99I突变株与野生株生长趋势一致,而E058△50%compT::cat、E058△100%compT::cat、 E058compTD97H、E058compTS99I生长受到抑制,说明compT所编码的cOmpT具有水解鱼精蛋白的功能。荧光定量PCR结果显示在E058中compT和pompT基因表达量差异不显著。随后我们分别将包含启动子区域完整ORF的compT基因序列和带有compT启动子区域完整ORF的pompT基因序列插入到pACYC184质粒,成功构建回复株ReE058△100%compT::cat1、ReE058△100%compT::cat2,进行鱼精蛋白抑制试验结果发现两个回复株都能回补到野生株水解鱼精蛋白的水平。体内动态分布试验结果表明,与野生株E058相比,突变株E058△100%compT::cat、E058△50%pompT::cat毒力均显著致弱,而突变株E058△50%compT::cat、E058△100%pompT::cat并未表现致弱。进一步通过荧光定量PCR结果分析发现两个毒力相关基因iucD和fimC在E058△50%compT::cat表达量均显著高于E058△100%compT::cat。LD50试验结果显示,有抗突变株E058△50%pompT::cat较野生株E058致病性下降10倍,无抗突变株E058△50%pompT致病性并没有下降。针对这一现象,我们将带有pompT启动子区域50%pompT-FRT基因序列插入到pACYC184质粒,获得回复株ReE058△50%pompT::cat,但其LDso结果显示并没有回补到野生株水平；突变株E058△50%compT::cat、E058△100%pompT::cat致病性没有减弱,E058△100%pompT::cat较野生株E058致病性下降10倍与体内定居实验结果一致。血清杀菌试验结果表明各突变株、回复株与野生株对SPF鸡血清杀菌作用不敏感。上述结果表明,相对于染色质OmpT (cOmpT),质粒OmpT (pOmpT)在生物学特性、对APEC的致病性等方面,具有其特殊性,表现在：(1)pOmpT不能水解鱼精蛋白；(2)敲除其50%片段,突变株的致病性显著下降,而敲除其整个阅读框,突变株的致病性反而不下降。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61

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